目的:通过《中药新药临床指导原则》《中医病证诊断疗效标准》和多个版本《中医妇科学》建立的更年期综合征辨证标准的对比分析,以及学术界临床辨证的全方位比较,阐明本病辨证失范的表现形式和成因,提出重新辨证规范的思路与方法;验证来自传统方剂文献和临床经验的干预更年期综合征肝肾阴虚证中药小复方——济阴颗粒的药效学,揭示本剂的作用机制,为后续新药研制提供科学依据。材料与方法:1.女性更年期综合征中医辨证失范考察分析1.1对辨证标准文献《中医病证诊断疗效标准》《中药新药临床研究指导原则》和3个版本统编教材《中医妇科学》辨证标准的异同进行比较分析。1.2检索中国知网、重庆维普、CBM期刊数据库近5年中医临床辨证治疗更年期综合征文献,归纳统计学术界辨证离散程度,主证所属症状构成。1.3逻辑分析更年期综合征辨证存在根本问题,阐明重新辨证规范的思路与方法。2.动物实验部分2.1更年期综合征造模方法2.1.1小鼠造模方法小鼠麻醉后将背部中线长毛剪除,切开皮肤和背部肌肉,结扎卵巢下输卵管及脂肪,摘除双侧卵巢,后缝合伤口。腹腔注射青霉素连续3d。1周后对其进行阴道涂片,连续5d,未出现动情期的小鼠造模成功。2.1.2大鼠造模方法大鼠每日腹腔注射VCD溶液,连续60d后停药。造模开始后第120d,所有大鼠(包括空白对照组10只)眼眶静脉取血,检测血清雌二醇(E2)含量,血清E2含量明显低于空白对照组最低值的大鼠造模成功。2.2药效学评价方法2.2.1小鼠自主活动检测末次给药30min后将小鼠放入自主活动箱内,适应5min后测定10min内的活动次数。2.2.2小鼠阈下戊巴比妥钠协同作用检测末次给药30min后各组小鼠腹腔注射30mg/kg戊巴比妥钠,观察并记录15min内翻正反射消失达1min以上的动物只数。2.2.3小鼠记忆能力检测采用逐步引导方式训练小鼠游出迷宫,训练完成后记录从起点到终点小鼠全程所花费的时间。2.2.4小鼠抗疲劳能力检测以小鼠沉入水底10s为标记,记录游泳时间。2.2.5其它采用ELISA方法检测血清E2、FSH含量;通过光学显微镜进行卵巢、子宫形态学检测;2.3济阴颗粒作用机制研究采用免疫组化方法检测卵巢细胞P53,Caspase-3,8,9,Bax,Bcl-2,Apaf-1蛋白的表达。采用荧光RT-PCR方法检测AIF,Endo-G,Caspase-3,8,9,Bax,Bcl-2,Apaf-1 m RNA的表达。3数据分析方法采用SPSS10.0统计软件进行处理,计量数据以x±s表示,采用ONE-Way ANOVA及卡方检验进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.更年期综合征辨证失范潜在问题与成因包括《标准》《原则》和不同版本《中医妇科学》在内的权威文献,对更年期综合征建立的辨证标准彼此有别,相差悬殊,各行其是。剔除重复,共得阴虚内热、阴虚精亏、肾精亏虚、阴虚肝旺、肝肾阴虚、阴虚血燥、心肾不交、肾阴虚、肾阳虚、脾肾两虚、肾阴阳两虚11证。近五年学术界对更年期综合征临床辨证,猛增至58证,保留了权威文献中的9证,其余49证皆属新增。足见更年期综合征临床辨证随意性之强,离散度之大。而出现频次最高的肝肾阴虚证和肝郁气滞证的症状构成分别为94和76种,远远超出本病实际出现症状的10数倍。如此严重的“证出多门”的混乱现象,与证名称谓不规范,多证交叉重叠,同证异名有关;与本病辨证标准的制订互不通气,各搞一套,缺乏统一协调有关;同时与虚拟症状的大量羼入,进而抽象出众多的虚拟之证有关。2.济阴颗粒药效学研究结果2.1济阴颗粒对小鼠自主活动的影响空白对照组与假手术组小鼠自主活动无差别;模型组与空白对照组比较有显著差异(P<0.01),模型组小鼠自主活动剧烈;各给药组与模型组比较,除济阴颗粒低剂量组外均存在显著性差异(P<0.01),即除济阴颗粒低剂量外其它药物皆可有效降低小鼠自主活动;中药对照组与济阴颗粒高剂量组比较,在统计学上无显著性差异(P>0.05)。除西药对照组外,各给药组与空白对照组比较均存在显著差异(P<0.01)。2.2济阴颗粒对阈下戊巴比妥钠协同作用的影响空白对照组与假手术组小鼠在阈下戊巴比妥钠干预下睡眠情况无差异。模型组与空白对照组比较有显著差异(P<0.01),模型组小鼠在阈下戊巴比妥钠干预后无进入睡眠情况。与模型组比较,显示济阴颗粒能增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的睡眠只数,中、高剂量组与之存在统计学差异(P<0.01),且与中药对照药效果相当。与空白对照组比较,治疗组中除济阴颗粒低剂量组外,各组与之无统计学差异。2.3济阴颗粒对小鼠记忆能力的影响空白对照组与假手术组小鼠游离水迷宫所需时间无差异。模型组与空白对照组比较有显著差异(P<0.01),模型组小鼠花费时间明显增加。与模型组比较,显示济阴颗粒能缩短小鼠困于水迷宫的时间,中、高剂量组与之存在统计学差异(P<0.01),且与中药对照药效果相当。各给药组与空白对照组比较,除济阴颗粒低剂量组外,其它各组无差异。2.4济阴颗粒对小鼠抗疲劳能力的影响模型组与空白对照组小鼠游泳时间比较有显著差异,模型组小鼠坚持游泳时间显著缩短(P<0.01)。与模型组比较,显示济阴颗粒能延长小鼠游泳时间,中、高剂量组存在显著学差异(P<0.01),且与中药对照药效果相当。各给药组与空白对照组比较均存在显著差异(P<0.01)。2.5济阴颗粒对大鼠血清E2、FSH含量的影响与空白对照组比较,模型组血清E2含量明显降低(P<0.01),说明模型建造成功。与模型组比较,西药、中药对照组,济阴颗粒各剂量组血清E2含量明显提高,具有显著差异(P<0.01)。各给药组与空白对照组比较,除西药对照组外均存在显著差异(P<0.01)。空白对照组与模型组比较,模型组血清FSH含量明显升高(P<0.01),表明模型建造成功。与模型组比较,各给药组血清FSH含量均明显下降(P<0.01)。各给药组与空白对照组比较,济阴颗粒高剂量组和中药对照组与之无差异,其余各组均存在显著差异(P<0.01)。2.6济阴颗粒对大鼠卵巢、子宫重量指数的影响模型组与空白对照组,卵巢指数与子宫指数降低,皆存在明显差异(P<0.01)。与模型组比较,济阴颗粒高剂量组、西药对照组、中药对照组卵巢指数明显升高(P<0.01),各给药组子宫指数均有升高,存在显著差异(P<0.01)。各给药组与空白对照组比较,济阴颗粒低剂量组卵巢指数与之存在显著差异(P<0.01),其它各组无差异。各给药组与空白对照组比较,子宫指数无差异。2.4济阴颗粒对大鼠卵巢、子宫形态的影响空白对照组大鼠子宫内膜正常,子宫外膜层、肌层和内膜层清晰可见,腺体和毛细血管丰富,腺腔较大,结缔组织较疏松;模型组大鼠子宫内膜变薄,腺体和毛细血管较少,腺腔变小;经药物干预后,各治疗组大鼠子宫内膜明显增厚,腺体和毛细血管明显增多;其中西药对照组大鼠子宫内膜呈现过度增厚状态,子宫内膜细胞水肿,排列稀松。空白对照组大鼠卵巢中各级卵泡数量和形态正常,卵泡细胞核清晰可见,周围由细胞构成,可见清晰透明带。模型组大鼠卵巢卵泡大部分不发育或发育不良,卵泡细胞结构不清晰,细胞核消失,多程囊性结构包裹细胞。经药物干预后,各治疗组大鼠卵巢卵泡发育情况好转,各级卵泡数量增多,出现原始卵泡或成熟卵泡。3.济阴颗粒作用机制研究3.1济阴颗粒对Caspase依赖性细胞凋亡通路的影响3.1.1济阴颗粒对大鼠卵巢细胞P53蛋白表达的影响与空白对照组比较,造模后大鼠卵巢细胞凋亡蛋白P53的表达明显增加(P<0.01)。中药、西药对照组和济阴颗粒各剂量组卵巢细胞中P53蛋白的表达减少(P<0.01),其中济阴颗粒低剂量组的下调最为明显。各给药组与空白对照组比较,西药对照组、济阴颗粒中、高剂量组有显著差异(P<0.01),中药对照组与济阴颗粒低剂量组与之无统计学差异。3.1.2济阴颗粒对大鼠卵巢细胞Caspase-8 m RNA和蛋白的影响模型组与空白对照组比较,caspase-8 m RNA和蛋白的表达显著增强(P<0.01)。与模型组比较,除西药对照组外,各组caspase-8 m RNA和蛋白的表达均显著下降。西药对照组和模型组比较,caspase-8 m RNA表达无差异。与空白对照组m RNA表达情况比较,济阴颗粒中剂量组无统计学差异。与空白对照组蛋白表达情况比较,中药对照组和济阴颗粒中剂量组与之无统计学差异。m RNA和蛋白表达趋势基本一致。3.1.3济阴颗粒对大鼠卵巢细胞Caspase-3 m RNA和蛋白的影响模型组与空白对照组比较,模型组caspase-3 m RNA和蛋白表达显著上调,存在统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,各给药组caspase-3蛋白的表达均显著减弱(P<0.01);与模型比较,西药对照组caspase-3 m RNA表达无差异,其它各给药组皆有降低。与空白对照组比较,中药对照组caspase-3 m RNA表达与之无差异;济阴颗粒中剂量组蛋白表达与之无统计学差异。m RNA和蛋白表达趋势基本一致。3.1.4济阴颗粒对大鼠卵巢细胞Caspase-9 m RNA和蛋白的影响模型组与空白对照组比较,模型组Caspase-9 m RNA和蛋白的表达显著上调,有统计学意义(P<0.01)。各治疗组与模型组比较,Caspase-9 m RNA和蛋白的表达下调,有显著差异(P<0.01)。与空白对照组比较济阴颗粒高剂量组Caspase-9 m RNA表达与之无差异;西药、中药对照组,济阴颗粒低剂量组Caspase-9蛋白表达与之无统计学差异,三者之间比较无差异。3.1.5济阴颗粒对大鼠卵巢细胞Bcl-2 m RNA和蛋白的影响与空白对照组比较,模型组Bcl-2 m RNA和蛋白的表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较,中药对照药,济阴颗粒各剂量均可显著上调Bcl-2 m RNA表达(P<0.01),调节强度相当;济阴颗粒中、高剂量组蛋白表达与之存在显著差异;西药对照药对Bcl-2m RNA和蛋白表达无明显上调作用。与空白对照组比较,各组Bcl-2 m RNA表达均有显著差异,济阴颗粒中剂量与高剂量组蛋白表达与之无差异。m RNA和蛋白表达的趋势一致。3.1.6济阴颗粒对大鼠卵巢细胞Bax m RNA和蛋白的影响与空白对照组比较,模型组Bax m RNA和蛋白的表达显著增强(P<0.01)。与模型组比较,各治疗药均可减弱卵巢细胞Bax m RNA表达;除济阴颗粒低剂量组外,各给药组Bax蛋白表达明显降低。与空白对照组比较,西药对照组Bax m RNA表达与之无差异,济阴颗粒高剂量组Bax蛋白表达与之无差异。m RNA和蛋白表达的趋势基本一致。3.1.7济阴颗粒对大鼠卵巢细胞Apaf-1 m RNA和蛋白的影响与空白对照组比较,模型组Apaf-1 m RNA和蛋白的表达显著增强(P<0.01)。与模型组比较,济阴颗粒各剂量组均可显著降低Apaf-1 m RNA和蛋白的表达。与空白对照组比较,中药对照组,济阴颗粒各剂量组Apaf-1 m RNA表达与之无差异;各给药组蛋白表达均存在显著差异(P<0.01)。3.2济阴颗粒对Caspase非依赖性细胞凋亡通路的影响3.2.1济阴颗粒对大鼠卵巢细胞AIF m RNA表达的影响与空白对照组比较,模型组卵巢细胞AIF m RNA表达明显增强。与模型组比较,各治疗药均可减弱卵巢细胞AIF m RNA的表达。济阴颗粒高剂量的下调作用最显著。与空白对照组比较,各组均存在显著差异。3.2.2济阴颗粒对大鼠卵巢细胞Endo-G m RNA表达的影响与空白对照组比较,模型组卵巢细胞Endo-G m RNA表达明显增强。与模型组比较,各中药组均可减弱卵巢细胞Endo-G m RNA的表达。除西药对照组外,各给药组Endo-G m RNA表达与空白对照组无差异。西药对照药对Endo-G m RNA表达的降低无明显影响。结论:1.对更年期综合征重新辨证规范的思路与方法。应改变针对本病中西医病名或主症辨证规范的作法,围绕协调统一的病名辨证规范;对称谓不规范、交叉重叠、同证异名者,按照逻辑关系,结合病情,去伪存真,统一称谓,删繁就简;剔除大量与病证诊断无关的症状,确定症状与证的从属关系,结合临床实际规范同症异名、交叉重叠症状和舌脉象。在经过必要“瘦身”后,建立客观性较强的预调查量表,借以开展前瞻性流行病学调查研究。应克服以往普遍利用某一权威辨证标准事先给定诸证名称和诊断标准的先验作法,对采集信息聚类分析后,结合德尔菲法做出客观判断。2.针对去势更年期综合征小鼠,济阴颗粒可有效降低其自主活动,增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的睡眠只数,具有镇静安神的作用;可显著缩短去势更年期小鼠游出水迷宫的时间,提高小鼠记忆能力;延长小鼠游泳时间,提高小鼠抗疲劳能力。济阴颗粒可有效升高更年期综合征大鼠血清E2含量,同时降低FSH含量。改善更年期大鼠卵巢和子宫内膜形态,增加卵巢指数和子宫指数,延缓卵巢衰老。因此,济阴颗粒可有效改善更年期综合征表现,对实验性更年期综合征有确切疗效。3.济阴颗粒可降低更年期综合征大鼠卵巢细胞P53蛋白、Caspase-3 Caspase-8,Caspase-9,Bax,Apaf-1蛋白和m RNA的表达,增强卵巢细胞Bcl-2 m RNA和蛋白的表达,抑制Caspase依赖性细胞凋亡通路,从而抑制卵巢细胞凋亡。是济阴颗粒干预更年期综合征的作用机制。4.济阴颗粒可下调卵巢细胞AIF m RNA与Endo-g m RNA的表达,抑制Caspase非依赖性细胞凋亡通路,从而抑制卵巢细胞凋亡。是济阴颗粒干预更年期综合征的作用机制。