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天然免疫是机体宿主抵抗病毒入侵的第一道防线,其中最为核心的部分是宿主细胞通过其模式识别受体探测到入侵的病毒从而产生干扰素,限制病毒的复制和感染。干扰素在天然免疫中发挥着极其重要的作用,病毒也在长期的进化过程中形成了逃避天然免疫干扰素的有效策略和机制。先前研究表明相对于猪瘟病毒和猪流感病毒等病毒,猪圆环病毒2型(PCV2)感染仔猪后血浆中干扰素水平较低。体外实验也表明PCV2感染可以分别抑制类浆样树突状细胞和外周血淋巴细胞分泌IFN-α和IFN-γ,但对于PCV2感染抑制干扰素产生的机制尚不清楚。因此,本实验以PK-15细胞为模型,研究PCV2感染PK-15细胞后抑制IFN-β产生的信号通路和机制,为研究PCV2与天然免疫相互作用和PCV2的致病机制提供理论基础。为了快速检测PCV2感染PK-15细胞后IFN-β变化,本实验首先构建含有猪IFN-β启动子的萤光素酶报告质粒,通过脂质体转染法将萤光素酶报告质粒转染PK-15细胞,转染poly(I:C)(1μg/ml)刺激12h时,萤光素酶报告质粒活性相对于对照组显著增加(P<0.05),表明构建的猪IFN-β启动子双萤光素酶报告质粒具有良好活性,为进一步探讨猪的β干扰素信号通路研究奠定了基础。干扰素介导的抗病毒反应是天然免疫中的重要组成部分。以往研究表明PCV2能抑制干扰素产生,但关于其抑制干扰素产生的具体分子机理尚不清楚。PCV2(MOI=0.或 MOI=1)感染 PK-15 细胞 24h 后,转染 ISD 和 poly(I:C),12h 后检测 IFN-β-Luc 活性,IFN-β的mRNA表达和IRF3-Luc活性。结果显示,PCV2(MOI=1)显著抑制了 ISD和poly(I:C)诱导的IFN-β产生(P<0.05)和IRF3-Luc启动子活性(P<0.05),而与AP-1&NF-κB-Luc 无关(P>0.05);PCV2 感染 PK-15 细胞后,分别转染 STING、TBK1、IRF3和IRF3/5D,24h后检测检测IFN-β-Luc活性和IFN-β的mRNA表达。结果显示PCV2显著抑制了 STING、TBK1、IRF3和IRF3/5D诱导的IFN-β的双萤光素酶活性和mRNA表达(P<0.05);PCV2感染PK-15细胞后,分别转染STING和ISD,进行免疫印迹和免疫荧光,结果表明PCV2感染PK-15细胞后显著抑制STING和ISD诱导的IRF3入核。以上结果共同表明PCV2感染PK-15细胞后,作用于IRF3信号通路下游,影响p-IRF3入核,从而抑制IFN-β的产生。前面我们实验结果表明PCV2能抑制IFN-β产生,然而哪些PCV2病毒的编码蛋白参与抑制PK-15细胞IFN-β的产生,尚不清楚。本实验首先构建了 ORF1,ORF2,ORF3,ORF4的pcDNA3.1(+)真核过表达载体,PK-15细胞分别过表达ORF1-Flag,ORF2-Flag,ORF3-Flag 和 ORF4-Flag,24h 后转染 ISD、poly(I:C)和 IRF3/5D,采用双萤光素酶报告基因法检测IFN-β的启动子活性,结果表明PCV2 ORF1开放阅读框编码蛋白显著抑制了 ISD、poly(I:C)和IRF3/5D诱导的IFN-β启动子活性(P<0.05);ORF1-Flag,IFN-β 和 pRL-TK 分别与过表达质粒 STING、TBK1、IRF3 和 IRF3/5D 转染至PK-15细胞,36h后双萤光素酶报告基因法检测IFN-β启动子活性,结果显示ORF1显著抑制了 STING、TBK1、IRF3和IRF3/5D诱导的PK-15细胞IFN-β启动子活性(P<0.05);ORF1-Flag,IRF3-Luc 和 pRL-TK 共转染至 PK-15 细胞,24h 后分别使用 ISD和poly(I:C)刺激12h,双萤光素酶报告基因法检测IRF3-Luc启动子活性,结果显示ORF1显著抑制了 ISD和poly(I:C)诱导的IRF3-Luc的启动子活性,说明ORF1主要通过IRF3信号通路抑制IFN-β产生;PK-15细胞转染ORF1-Flag的36h后,提取蛋白样品,进行免疫共沉淀实验,结果显示ORF1-Flag主要与核转运因子KPNA3互作而不是KPNA4,转染ORF-Flag后KPNA3与p-IRF3的结合相对于对照组减少;然后构建缺失核定位序列(NLS)的ORF1-Flag△NLS质粒,将其与ORF1-Flag分别转染至PK-15细胞36h后,提取蛋白样品,进行免疫共沉淀实验,结果显示ORF1-Flag可以与核转运因子KPNA3互作,缺失NLS后的ORF1-Flag△NLS与KPNA3的互作消失,ORF1-Flag△NLS 组 KPNA3 与 p-IRF3 的结合相对于 ORF1-Flag 组增多,且 ORF1-Flag△NLS恢复了 ORF1-Flag对IFN-β启动子活性的抑制作用,说明核定位序列是ORF1抑制IFN-β启动子活性的关键氨基酸序列;通过突变ORF1-Flag上核定位序列上的氨基酸位点转染PK-15细胞,36h后提取蛋白进行免疫共沉淀实验,结果显示ORF1核定位序列上的30K-K-I-R33氨基酸位点突变体与KPNA3的互作减弱最显著,恢复了ORF1抑制的IFN-β启动子活性。以上结果表明,PCV2 ORF1通过其核定位序列与核转运蛋白KPNA3结合,竞争性抑制了 KPNA3对p-IRF3的转运,从而抑制了 IFN-β的产生,为PCV2病毒逃逸天然免疫的分子机制奠定了基础,有助于我们更好的理解PCV2病毒与宿主免疫的关系。