研究背景:胰腺癌的死亡率在所有恶性肿瘤中位居第七,因为确诊较晚和缺乏有效的治疗策略,总体5年生存率低于10%。目前治疗胰腺癌的方法有肿瘤手术、化学治疗、放射疗法、免疫治疗、靶向治疗等,但总体疗效不佳,如何有效提高胰腺癌相关的平均生存率至关重要。端粒酶和永生化与肿瘤之间存在着密切联系,肿瘤十大特征之一的永生化主要是由于85%的肿瘤细胞高表达端粒酶。因此,端粒酶在肿瘤的诊断及治疗中的重要性逐渐被人们认识,本课题旨在筛选出新的胰腺癌细胞端粒酶活性调节因子,并探索其作用机制及功能,为胰腺癌的早期诊断及治疗提供新方法和策略。端粒酶是具有逆转录酶功能的核糖核蛋白,它以自身的RNA为模板在端粒末端不断增加（TTAGGG）的重复序列,使得端粒避免缩短,从而细胞可以避免衰老和死亡。绝大部分正常体细胞内端粒酶呈阴性,而肿瘤细胞端粒酶活性被激活。所以端粒酶的活性可以作为肿瘤细胞的特异生物学指标之一,它的检测对于肿瘤细胞的研究有着重要意义。目前端粒酶活性检测的方法有很多,最传统的方法是TRAP,它的灵敏度非常高。但是也存在着过高的假阳性、无法准确定量、同位素污染及PCR产物饱和等缺点,其它一些方法虽然有高灵敏度、省时等优点,但是需要纳米材料及专业的检测设备,不利于在普通实验室推广。因此本研究想建立一种生物素标记的直接端粒酶活性检测方法（Biotin-labeled Direct Telomerase Assay,Biotin-DTA）,能够准确定量端粒酶活性,并且不需要PCR及同位素,为实验室研究端粒酶提供一种新方法。此外,端粒酶活性的调节机制复杂,涉及到端粒酶表达水平、端粒酶装配、端粒酶定位等多个环节的调控,新的端粒酶调节分子亟待发现。实验方法:1、以过量表达端粒酶的293T细胞建立生物素标记的直接端粒酶活性检测方法。293T细胞转染Flag-h TERT、h TR质粒（称为293T Super Telomerase,简称293T ST）,Western blot检测Flag-h TERT的表达情况。对293T ST细胞的裂解液提取物（称为Input）行免疫共沉淀,得到的液体为IP Eluate,Western blot检测Input、IP后液体及IP Eluate中Flag-h TERT情况,评价免疫共沉淀的效率。以得到的IP Eluate来做端粒酶延长反应。2、对该方法进行反应体系的优化,包括培养温度、反应时间、KCl浓度等。首先比较32℃和37℃培养条件下端粒酶活性的差异,其次设置不同的反应时间,明确信号最强的反应条件,最后设置不同的KCl浓度,得出KCl的最佳浓度。3、对该方法进行验证,包括可重复性、结果的可靠性和准确性、检测的灵敏度和稳定性等。首先检测了五个重复样品的端粒酶活性以明确该方法的可重复性,其次分别用1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl的IP Eluate来做端粒酶延伸反应,检测其活性变化,得出该方法可以准确定量分析端粒酶活性。通过瞬时转染端粒酶调节因子PES1的si RNA,使用该方法检测端酶活性的改变,进一步证实该方法的可靠性。通过梯度稀释样品的实验,用Biotin-DTA的方法检测端粒酶活性,并与TRAP方法进行比较,明确该方法的稳定性。最后用新方法检测Hep G2细胞内源性端粒酶活性,验证该方法的灵敏度。4、通过免疫共沉淀、质谱分析筛选出可能与h TERT或者h TR相结合的蛋白。再从中选出候选基因,通过免疫共沉淀和端粒酶活性检测等进一步明确候选基因和h TERT的相互作用及对端粒酶活性的调节。5、通过免疫共沉淀、WB、q RT-PCR等探索筛选到的端粒酶结合因子LDHB是否通过影响h TERT或者h TR的表达来调节PANC-1细胞端粒酶活性;通过RIP的方法明确该因子是否通过影响h TERT和h TR的装配来调节PANC-1细胞端粒酶活性。6、通过端粒长度测定、细胞衰老、细胞生长曲线等实验进一步探索LDHB是否影响PANC-1细胞的增殖和衰老。7、通过胰腺癌细胞的裸鼠成瘤实验,从体内研究进一步验证LDHB的功能。结果:生物素标记的无放射性的直接端粒酶活性检测方法能够准确检测端粒酶活性,是一种可靠的端粒酶活性检测方法,有较好的分辨率及灵敏度,且与传统的TRAP相比,没有了PCR,定量更为准确。并且需要的材料、条件相对简单,值得推广。温度对于外源性端粒酶的表达量很重要,细胞处于32℃培养后,Flag-h TERT的表达量明显高于常规37℃培养的细胞,经过免疫沉淀后,能够获得更多的端粒酶,可以提高端粒酶活性。在检测端粒酶活性时,KCl浓度为200m M、250m M时活性最高,推荐使用。LDHB与h TERT有相互作用,它们是直接结合的,不依赖于h TR。在胰腺癌细胞中敲低LDHB,h TR的表达水平升高,h TERT的m RNA表达水平无明显变化,但是h TERT的蛋白表达水平轻度下降。敲低LDHB能够抑制h TERT与h TR的装配。PANC-1细胞培养于不同浓度的丙酮酸钠、乳酸钠中,端粒酶活性无明显改变。PANC-1细胞敲低LDHB后,它的端粒酶活性下降,端粒长度缩短,细胞衰老增加,生长受到抑制。敲低LDHB能够抑制胰腺癌细胞裸鼠成瘤能力。结论:生物素标记的无放射性的直接端粒酶活性检测方法是一种稳定的、可靠的、可行的端粒酶检测方法,可用于端粒酶调节因子的筛选并在实验室推广。LDHB具有调节胰腺癌细胞端粒酶活性的作用,敲低LDHB后,h TR的表达水平升高,h TERT的蛋白表达水平轻度下降。LDHB不是通过代谢途径来调节端粒酶活性的,而是通过影响h TERT的蛋白表达和h TERT与h TR的装配来调节端粒酶活性。长期敲低LDHB后,胰腺癌细胞端粒酶活性下降,端粒长度缩短,细胞衰老增加,生长受到抑制。敲低LDHB后,胰腺癌细胞成瘤能力减弱,肿瘤生长受到抑制。