蓝藻16S rRNA-23S rRNA基因间隔区序列(ITS)多拷贝分析

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提取12个蓝藻样品(实验室编号为S1-S12)全DNA,PCR扩增16S rRNA-23S rRNA基因间隔序列(ITS)并测序;采用Cluster X1.83对所得序列进行比对,并对比对结果进行人工校正;采用割胶回收电泳检测、菌液PCR及混合模板PCR扩增三种方法分析ITS-L2(最长拷贝)。  结果显示:  (1)ITS-L2为假阳性条带,是由ITS-S和ITS-L1形成的异源双链。  (2)色球藻目中Synechococcus7942ITS序列仅含一种类型拷贝,包含tRNAAla和tRNAIle编码序列。  (3)颤藻目中Oscillotoria tenuis、Microcoleus raginatus、Leptolyngyoideae sp.R8、Leptolyngyoideae sp.R11、Phormidium sp.R30,念珠藻目中Anabaena aequolis Borge、Nostoc sp.R34、Nostoc sp.R35、Nostoc calcicola,真枝藻目中Hapalosiphon welwitschii、Mastigocladus sp.ITS序列均为两种类型的拷贝,其中ITS-S均不含tRNAAla和tRNAIle编码序列,ITS-L1均包含tRNAAla和tRNAIle编码序列。  以蓝藻中部分念珠藻目和真枝藻目为实验材料,采用Cluster X1.83对ITS-S和ITS-L1序列进行比对,并对结果进行人工校正;用Mega5.0软件对ITS-S,ITS-L1进行碱基组成、遗传距离、碱基替换饱和性分析;用基于ITS-S、ITS-L1序列的系统树与基于16S rRNA系统树进行比较,以在16S rRNA系统树(中出现并得到较高支持率(BP值)的分支是否在ITS-S、ITS-L1系统树中得到得到重现以及是否也获得相应的支持率(BP值)作为参照判断ITS-S和ITS-L1作为系统学研究的分子标记的适用性。  结果显示:所分析的念珠藻目和真枝藻目ITS序列特点如下:  (1)ITS-S序列、ITS-L1序列平均长度分别为324.6bp、583.2bp。  (2)ITS-S序列的A、T、C、G平均含量分别为36.7%、23.9%、16.3%、23.1%,GC含量平均值为39.4%;ITS-L1序列A、T、C、G平均含量分别为31.8%、25.4%、17.9%、24.9%,GC含量平均值为42.8%。  (3)ITS-S序列中含有305(433)个变异位点,203(433)个简约信息位点;ITS-L1序列中含有454(727)个变异位点,317(727)个简约信息位点。  (4)ITS-S和ITS-L1遗传距离的平均值分别是0.381和0.328。  (5)ITS-S和ITS-L1碱基替换均未达到饱和。  (6)在基于16S rRNA序列的MP树和ML树中获得良好支持率的分支Ⅰ、分支Ⅱ、分支Ⅲ、分支Ⅳ、分支Ⅴ在基于ITS-S序列的MP树和ML树中仅重现了分支Ⅱ、分支Ⅲ和分支Ⅴ,而在基于ITS-L1序列构建的MP树和ML树中均得到重现并获得良好的支持率。  综合以上结果,可以认为:  (1)蓝藻16S rRNA-23S rRNA基因间隔序列(ITS)尚未完成协同进化;  (2)ITS-S很可能是由ITS-L1缺失tRNAAla和tRNAIle编码序列而来,ITS-L1更适合作为系统学研究的分子标记。
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