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目的:以经典名方生地黄汤为研究对象,运用现代技术研究手段,从造模方法验证、最佳配伍筛选、成分效应相关性等方面进行研究,分析生地黄汤不同制备方法、不同配伍比例中指标性成分的含量、效应等方面的差异,寻求其发挥滋阴凉血、化瘀止血作用的最佳配伍比例及成分效应之间的相关性,探讨生地黄汤配伍规律,为今后进一步阐明生地黄汤的配伍机制、开展制剂研究以及指导临床合理用药提供实验依据。 方法: 1.运用羟基脲、羟基脲+氢化可的松、羟基脲+肾上腺素三种不同方法建立“肾虚血瘀”动物模型,测定其血常规、血液流变学、凝血四项等指标对三种不同模型进行验证,筛选适宜本实验的“肾虚血瘀”模型。 2.研究生地黄汤不同制备方法对“肾虚血瘀”模型大鼠主要药效学指标的影响,利用在1实验中确定的最佳模型进行造模,分别给予水提生地黄、大黄、生地大黄合煎、生地大黄单煎合并药液进行灌胃给药,分别测定血常规、血液流变学、凝血四项相关指标,大鼠血浆中E2、P、SOD1、ESR2、LPO、TXA2、Cr、PGE2含量的变化以及HE染色观察子宫、卵巢形态学变化,免疫组化法检测对子宫、卵巢雌激素受体蛋白表达的影响,综合分析确定生地黄汤在治疗“肾虚血瘀”型崩漏的最佳制备方法。 3.研究生地黄汤不同配伍比例对“肾虚血瘀”模型大鼠主要药效学指标的影响,利用2实验中确定的最佳制备方法,分别给予水提生地黄、大黄、合煎60:1、合煎30:1、合煎15:1药液进行灌胃,分别测定血常规、血液流变学、凝血四项相关指标,大鼠血浆中E2、P、SOD1、ESR2、LPO、TXA2、Cr、PGE2含量的变化以及HE染色观察子宫、卵巢形态学变化,免疫组化法检测对子宫、卵巢雌激素受体蛋白表达的影响,综合分析确定生地黄汤在治疗“肾虚血瘀”型崩漏的最佳配伍比例。 4.采用HPLC色谱法建立生地黄汤不同制备方法、不同配伍比例样品中主要化学成分(梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷D、地黄苷A、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)的含量测定方法,并对方法学进行考察;采用SPSS19.0双变量相关性分析功能,对生地黄汤主要化学成分含量与其效应结果进行皮尔逊相关分析,初步阐明成分效应之间的相关性。 结果: 1.三种“肾虚血瘀”模型的验证:通过对羟基脲、羟基脲+氢化可的松、羟基脲+肾上腺素三种模型的验证,结果显示羟基脲+氢化可的松组可显著性缩短模型组大鼠的凝血时间、降低血液黏度、升高红细胞聚集指数、升高白细胞数(WBC)、血红蛋白HGB、降低红细胞(RBC)、血小板(PLT)。 2.生地黄汤不同制备方法对“肾虚血瘀”模型大鼠主要药效学指标的影响。结果表明:与空白组比较,模型组雌鼠PT、APTT时间显著缩短,TT时间显著性延长,血液中高、中、低切黏度升高,白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HGB)升高,红细胞(RBC)、血小板(PLT)降低,差异具有显著性;与模型组比较生地大黄合煎组可延长凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、降低凝血酶时间(TT),同时可降低中切、低切黏度,升高红细胞计数(RBC)、降低白细胞计数(WBC)、降低血红蛋白(HGB)、升高血小板(PLT)差异具有显著性;模型组中超氧化物歧化酶(SOD1)、雌激素受体β2(ERS2)、血栓素(TXA2)显著性降低,过氧化脂质(LPO)、肌酸酐(Cr)、前列腺素(PGE2)显著性升高;与模型组比较合煎组均可显著性升高超氧化物歧化酶(SOD1)、雌激素受体β(ERS2)、血栓素(TXA2)、E2、P,降低过氧化脂质(LPO)、肌酸酐(Cr)、前列腺素(PGE2); 卵巢组织HE染色光镜下观察,空白组卵巢皮质各级卵泡清晰可见,次级卵泡数量多,卵泡腔明显;模型组与空白组比较初级、次级卵泡数量明显减少,间质结缔组织增多,计数卵泡数量有显著差异,具有统计学意义;其中合煎组初级卵泡增多明显,ER表达明显;各给药组中,合煎组、大黄组、合并组与模型组比较,子宫内膜均增厚明显,腺体多,基质细胞肥大,子宫腺腺细胞中ER表达明显。 3.生地黄汤不同配伍比例对“肾虚血瘀”模型大鼠主要药效学指标的影响。结果表明:与模型组比较,生地大黄合煎30:1组可延长凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、降低凝血酶时间(TT),同时可降低中切、低切黏度,升高红细胞计数(RBC)、降低白细胞计数(WBC)、降低血红蛋白(HGB)、升高血小板(PLT)差异具有显著性;同时可显著性升高超氧化物歧化酶(SOD1)、雌激素受体β(ERS2)、血栓素(TXA2)、E2、P,降低过氧化脂质(LPO)、肌酸酐(Cr)、前列腺素(PGE2); HE染色下观察大鼠卵巢结构显示:30:1组卵巢发育期卵泡数量较多,多以次级卵泡多见,卵泡细胞、黄体细胞中ER表达明显;30:1组与模型组比较,子宫内膜均增厚明显,腺体多,基质细胞肥大;ER在子宫表达显著。 4.11种成分的含量测定及成分效应间的相关性分析。结果表明:在一定范围内,梓醇、没食子酸、桃叶珊瑚苷、地黄苷D、地黄苷A、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积积分值Y与进样量X线性关系良好,方法学考察结果表明仪器的精密度良好、供试品溶液在24h内稳定性良好、各化学成分的重现性良好、各化学成分的回收率良好; 皮尔逊相关分析表明,生地黄汤11个主要化学成分中,梓醇、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚与药效指标SOD1增加密切相关;没食子酸与药效指标TT、P、PGE2有密切相关性(缩短TT、增加P、降低PGE2);桃叶珊瑚苷与药效指标Fbg、TXA2、PGE2有密切联系(降低Fbg、PGE2,升高TXA2);地黄苷D、大黄酸与药效指标Cr有密切联系(降低Cr);大黄素与药效指标低切粘度(血液黏度)有密切联系(降低地切变率血液粘度);其余化学成分与所测指标相关关系不明显。 结论:通过对崩漏-肾虚血瘀大鼠最佳模型、生地黄汤最佳制备方法、生地黄汤最佳配伍比例的筛选以及对生地黄汤中有效成分含量变化研究,利用高效液相色谱与药效学指标相互结合的方法筛出最佳造模方法为羟基脲+氢化可的松,最佳制备方法为合煎法,最佳配伍比例为30:1,结果证明在合煎30:1时肾虚血瘀-崩漏模型大鼠凝血系统、血液黏度、抗炎作用、抗氧自由基和肾功能的改善作用最为明显,进而印证了生地黄汤不同制备方法、不同配伍比例对体内药效具有一定的差异性。该研究为阐明生地黄汤治疗相关疾病的物质基础及其制剂质量控制提供了实验依据,为今后进一步开展生地黄汤的配伍机制、制剂研究以及指导临床合理用药奠定坚实基础。