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4-1BB配体(4-1BB ligand，4-1BBL)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，主要表达在抗原递呈细胞(APC)，包括CD40活化的B细胞，γ-IFN活化的巨噬细胞和树突状细胞，还可在B细胞性恶性肿瘤细胞株及单核细胞上表达。其相应受体4-1BB则诱导表达于活化的T淋巴细胞表面，4-1BB／4-1BBL的相互作用在促发和调节机体免疫应答，特别是在机体的抗肿瘤免疫、移植免疫和自身免疫应答中发挥关键性的作用。近年来，4-1BBL分子在肿瘤免疫治疗中的潜在应用价值正倍受关注。但迄今为止，国内尚无商品化的4-1BBL重组产品。鉴此，我们在国内率先采用基因工程技术克隆了编码人4-1BBL胞外段的cDNA，并在毕氏酵母GS115中进行表达，同时对获得的重组人可溶性4-1BBL蛋白潜在的生物学功能进行了系列探讨。 4-1BBL由255个氨基酸组成，是Ⅱ型跨膜糖蛋白，有膜结合型和可溶性两种形式。膜型分子可被蛋白酶裂解以可溶性形式(soluble 4-1BB ligand，s4-1BBL)存在，而185个氨基酸组成的胞外段则构成了s4-1BBL。 s4-1BBL作为一种新型共刺激分子在T细胞的活化、增殖、存活和对树突状细胞的体外诱导扩增及在肿瘤生物治疗方面的作用和价值则是本研究的重点；此外，成功构建了人4-1BB分子的转基因细胞，并通过此细胞对4-1BBL分子介导的反向信号传导亦做了初步的探讨，以期为4-1BBL和4-1BB分子在自身免疫和移植免疫中的作用提供理论依据。 一．重组人可溶性4-1BB配体(rhs4-1BBL)在毕氏酵母中的高效表达及鉴定 采用RT-PCR，PCR方法从CD40单抗活化的人扁桃体淋巴细胞中扩增出4-1BBL全长和胞外段基因，后者即为可溶性4-1BBL cDNA，并将之克隆入PUCTm载体；此cDNA序列经测序证实正确后再导入表达质粒pPICZαA的α信号肽序列中，构建成重组人可溶性4一IBB配体在毕氏醉母中的表彝及其生物学功能的研究中文摘要分泌型表达载体PPIc及认ees4一IBBL;Sacl限布雌内切酶酶切使之线性化，再电转化法将线性化的pPIcZaAees4一IBBL质粒导入毕氏酵母菌株GSll5，并以同源重组形式整合到酵母染色体的A0x位点，经ze。。i。抗性扮选阳性克隆。同时，挑取阳性克隆在含甲醇的培养基中诱导表达，并分别于培养的第24h，48h，矜h分别吸出酵母上清，离心后进行1挑DS一PAGE电泳和western Blotting分析鉴成s4一IBBL的表达情况，得到能在甲醇诱导下稳定分泌rhs4一IBBL的基因工程菌GSllswepPIczaA一s4一IBBL。应用全自动发酵装置进行发酵，经阴离子交换层析方法分离、纯化，获得纯度达9巩以上，分子蛋约21Kda的rhs4一IBBL重组蛋白，紫外分光光度仪定量其最高表达量达25 pg/ml。二.重组人可溶性4一IBB配体(rhs4一IBBL)的生物学功能探讨1 .rhs4一IBBL刺激T细胞特性的研究 T细胞的活化需要双重信号，即除A『川C复合物提供的特异性抗原刺激信号外，还需要非抗原特异的和非阳C限制的共刺激信号，T细胞只有获得这二个信号后，才能发生有效的活化、增殖，进而发挥其效应功能，如分泌细胞因子或细胞毒性T细胞(口L)的溶细胞效应。若无第一信号，可导致T细胞失活和死亡。同样若缺乏共刺激信号，T细胞将进入无反应状态，甚至发生凋亡。活化T淋巴细胞在宿主防御病毒感染、抗肿瘤和移植排斥中发挥重要作用，并参与自身免疫病的发展过程。因此，4一IBB/4一IBBL协同刺激信号对T细胞的激发和功能介导起着极其重要的调节作用。本研究结果显示: (1)纯化T细胞经cD3激发型单护喇激后12h，细胞呈现活化状态，显微镜下观察细胞增大增多，逐渐成团生长，T细胞表面4-- IBB分子开始表达，约48h达活化高峰，4一IBB分子表达阳性率达6既，并能维持4币d。(2)rha4一IBBL对T细胞存活和增殖的影响:cD3单抗激发的T细胞在一周内逐渐凋亡，加入 rhs4一1 BBL重组蛋白、cD28单抗(CD28InAb)或外源性IL--2后T细胞存活均明显延长(P<0 .05)，虽然二种共刺激分子对T细胞作用相仿(P>0 .05)，但和I卜2均具有协同效应，而且其联合后和I卜2共同作用更明显(P<0 .05)，最长可使T细胞存活6--7周。另外，3[Hl一dR结果也显示，rhs4一1 BBL和CD28InAb可以协同刺激活人可溶性今IBB配体在毕氏醉母中的表达及其生物学功能的研究中文摘要化T细胞体外增殖。以上结果均证实4一IBBL信号独立于CD28信号之外，并与CD28分子一样为T细胞的活化、增殖和进一步延长其存活提供了强有力的第二信号。(3)rhs4一IBBL和CD28InAb可以使活化T细胞产生白细胞介素2(I卜2)。1 L--2为淋巴细胞生长因子，在体外可以促进T细胞存活。rhs4一IBBL加CD28InAb联合促进T细胞分泌IL--2效应明显强于两者单独使用(P<0 .05)。另外，研究还发现，T细胞培养第2天分泌的I卜2高于第5天(P<0 .05)，此现象说明IL一2的分泌具有时效性，随时间的延长其含t下降是因为T细胞在生长过程中消耗了I卜2。这也进一步说明T细胞自分泌I卜2是影响T细胞扩增的主要因子。(4)rhs4一IBBL和CD28mAb对T细胞凋亡和细胞周期的影响:凋亡率检测结果显示，CD3单抗活化72一96h的T细胞平均凋亡率为37.5士3.5%，大部分细胞已开始进入凋亡期