海带(Saccharina japonica)是经济海藻栽培的主要对象,具有十分重要的经济和生态价值。随着海带栽培业的发展,由于环境污染、种质退化、管理不善等原因,病害频繁发生,造成了严重的经济损失。目前,与国外科学工作者对海带病害的关注度相比,国内对海带病害的研究并不多,且大多集中于病原分离与鉴定的研究。本文调查了海带育苗期与栽培期发生的几种病害,并以绿烂病为研究对象探究了病因,以期为研究海带病原的确定、检测、病理和防治等方面提供科学依据,有效降低栽培风险,提升海带栽培的经济效益和生态效益。本文首先对海带育苗期和栽培期发生的病害进行了调查研究,包括孢子体畸形病、幼苗绿烂、烂孔病、黄泡病、黑斑病,并对栽培水体进行水质因子检测;分离鉴定了各患病藻体上的可培养细菌;对苗期分离到的可培养细菌进一步分析其胞外褐藻酸降解酶、酪蛋白酶、果胶酶、纤维素酶活性。结合水质因子测定数据及胞外酶活性分析结果,在实验室条件下分别探究了环境因子、微生物与海带苗绿烂的关系,并检测海带苗绿烂过程中免疫防御酶的变化。本论文研究结果将为我国海带流行病学调查提供基础数据和支撑,为有效监控和预防海带苗绿烂的发生提供了科学依据。具体的研究内容和结果如下:1.海带育苗期和栽培期间的病害调查。2018年9月至2019年9月,对我国山东威海市、青岛市及福建省莆田市的海带育苗场及栽培海区发生的病害进行了调查研究。育苗期间山东威海某育苗场2018年9月及2019年9月都出现了不同程度的孢子体畸形病,育苗池水体水质因子检测数据显示,育苗过程中的温度、p H、盐度、营养盐指标正常(7.00～8.40℃、7.10～7.90、32～33‰、总氮:3.06～4.18 mg/L、总磷:0.20～0.47 mg/L)。2018年10月份山东威海另一育苗场出现绿烂病,它蔓延迅速、一周内便可造成大批苗体死亡。水质因子检测数据显示,温度、p H、盐度、光照指标正常(7.80～8.60℃、8.00～8.10、34～35‰、4100～4300lux),营养盐含量(总氮:30～35mg/L、总磷:2.10～2.20 mg/L)明显高于海带育苗规程建议用量。海带栽培期福建莆田某栽培海区2019年3月份出现烂孔病,水质因子检测数据显示,存在明显的盐度与温度分层现象,且盐度比正常海区低2～3‰,水温较往年同期高约2℃,p H(8.14～8.21)与总氮(0.32～0.34 mg/L)、总磷(0.02～0.03 mg/L)指标正常。山东威海某栽培海区2019年4月份出现黄泡病。山东青岛某栽培海区2019年7月份出现黑斑病。黄泡病和黑斑病的栽培水体未进行水质因子检测。海带栽培期病害烂孔病相对较严重。2.可培养细菌的分离与鉴定。对2018～2019年采集的患病海带样品进行了可培养细菌的分离、培养与鉴定,并对育苗期分离的细菌进行系统进化树分析。2018年从孢子体畸形的海带苗上共分离15属46株,其优势菌属为Yangia。系统进化树显示,这些细菌主要分布于4个门,其中α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)的菌株最多,占总分离细菌数的67.39%,其后依次为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)19.56%,厚壁菌门(Firmicutes)8.70%,拟杆菌门(Bacteroidetes)4.35%。2019年该育苗场发病的孢子体畸形样品中共分离11属126株,仍旧分到了较高比例的Yangia属细菌,除此之外,Thalassospira、Joostella以及Alteromonas属细菌的比例也很高。这些细菌主要分布于3个门,其中α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)的菌株最多,占总分离细菌数的61.11%,其后依次为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)26.98%,拟杆菌门(Bacteroidetes)11.91%。绿烂的水样中分离7属28株,其优势菌属为Yangia和Pseudoalteromonas。海带苗上共分离8属31株,其优势菌属为Yangia、Pseudoalteromonas和Glaciecola,这些细菌主要分布于3个门,其中γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)的菌株最多,占总分离细菌数的45.16%,其后依次为α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)38.71%,厚壁菌门(Firmicutes)16.13%。烂孔病海带及水样上共分离16属78株,其优势菌属为Cobetia。黄泡病海带上共分离11属36株,其优势菌属Psychrobacter。黑斑病海带上共分离5属41株,其优势菌属为Psychromonas。3.可培养细菌的胞外酶活性检测。育苗期病害是海带栽培过程中损失最严重的病害。本实验对育苗期出现的孢子体畸形病和绿烂病海带苗上分离到的203株细菌进行了胞外褐藻酸降解酶、酪蛋白酶、果胶酶、纤维素酶活性检测。未检测出具有果胶酶和纤维素酶活性的菌株。从孢子体畸形病上分离到的细菌中共检测到8属38株褐藻酸降解酶活性的菌株,以13株Yangia属细菌为主,其次为8株Thalassospira、5株Alteromonas、5株Joostella、4株Halomonas、1株Flavobacterium、1株Roseobacter、1株Pseudomonas;检测到8属14株具有酪蛋白酶活性的菌株,包括3株Bacillus、4株Pseudoalteromonas、1株Vibrio、1株Yangia、2株Thalassospira、1株Marinobacter、1株Idiomarina和1株Saccharospirillum。从绿烂病海带苗上分离到的细菌中共检测到3属10株具有褐藻酸降解酶活性的菌株,包括3株Pseudoalteromonas、6株Yangia和1株Marinomonas。检测到3属7株具有酪蛋白酶活性的菌株,包括5株Pseudoalteromonas、1株Yangia和1株Tenacibaculum。4.海带苗绿烂的病因分析。绿烂病是海带育苗期间常见的一种病害。2018年我们在山东一海带育苗场的病害调查中发现氮磷加富可能是引发海带苗绿烂的原因。为了探析海带苗绿烂病发生的原因,本研究进行了氮磷加富模拟实验、优势细菌分离鉴定、细菌回接感染、菌株Yangia在不同温度、光照和营养盐条件下的正交实验。模拟实验显示,在10℃、2000～4000 Lux、氮磷加富条件下,海带苗发生绿烂。从绿烂海带苗分离鉴定的附生优势菌为Yangia和Glaciecola。回接感染实验结果显示,在10℃、4000 Lux、氮磷加富情况下,添加Glaciecola.DH-2-3的实验组和未加菌的对照组出现绿烂,添加Yangia.SJ-H-12的实验组未出现绿烂;在14℃、2000 Lux、氮磷加富情况下,添加Yangia.SJ-H-12的实验组和对照组都出现绿烂。根据这些结果,从环境因子和微生物相互作用角度分析了海带苗绿烂病发生的原因,发现营养盐过量是导致幼苗绿烂的环境胁迫条件,Glaciecola.DH-2-3可能会加重这种绿烂的情况,而Yangia.SJ-H-12菌在低温时可能对海带幼苗的绿烂有抑制作用。进一步检测了海带苗在绿烂过程中免疫防御酶的变化。结果显示,蛋白浓度呈先降低后升高再降低的趋势变化,总体呈下降趋势;总抗氧化能力呈先升高再降低的趋势;超氧化物歧化酶(SOD)活力呈先升高后降低再升高的趋势变化,总体呈升高趋势;多酚氧化酶(PPO)活力呈先升高后降低再升高的趋势变化,总体呈升高趋势。本研究对海带病害的监测和预警具有一定意义。