赖氨酸脱羧酶(Lysine decarboxylase,LDC)主要功能是催化赖氨酸脱羧生成尸胺,是苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)中苦参碱(matrine,MA)和氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)生物合成途径的第一个关键酶,在其生化代谢过程中起着重要的作用。本研究以中药材苦豆子为材料,对盐胁迫处理下的苦豆子植株进行转录组测序分析,研究苦豆子响应盐胁迫的防御机制,为深入了解苦豆子的耐盐调控机理提供理论依据;在已经克隆获得赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC)全长序列的基础上,通过苦豆子SaLDC亚细胞定位、基因表达量与其直接产物尸胺含量的关系及原核表达研究,初步探讨赖氨酸脱羧酶基因的功能。研究结果如下:(1)用150 mmol/LNaCl溶液胁迫生长50d的苦豆子植株,分别于胁迫前(0 d)、胁迫后3d和7d采集叶片,进行转录组测序拼接得到415804个Unigene,有44177个unigene映射到KEGG代谢通路;两两比较不同NaCl溶液胁迫天数的基因表达量,分别发现了 4229(3 dvs 0 d)、2119(7 dvs 0 d)3953(3 dvs 7 d)个差异基因;韦恩分析显示0d,3d和7d有40个差异基因在三个阶段共有。GO富集分析表明这些差异基因主要参与催化应激反应、芳香族氨基酸代谢过程、离子和化合物的转运过程等;KEGG代谢通路富集分析表明富集的前三位代谢通路分别是代谢途径、次生代谢物的生物合成途径和氨基酸的生物合成途径;其中苯丙素的生物合成、次生代谢物生物合成等途径中的相关基因共同调控基因的表达,维持细胞离子平衡和渗透平衡,提高细胞盐耐受性。(2)随机挑选了响应盐胁迫代谢通路中显著下调的8个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,结果显示基因表达下调,与转录组测序分析得到的基因表达谱显示的变化趋势一致,说明测序结果具有很高的准确性和可靠性。(3)构建亚细胞定位载体pCAM35S-GFP-SaLDC,用mt-rk CD3991 marker共注射本氏烟叶片,激光共聚焦显微镜观察确定苦豆子赖氨酸脱羧酶基因定位于线粒体中。(4)无论是正常生长还是经150 mmol/L NaCl盐胁迫,SaLDC的表达在苦豆子中都具有组织特异性,具体表现为茎的表达量最高,其次是叶片,根中表达量最低,其直接产物尸胺含量变化与表达量一致,相关性分析显示赖氨酸脱羧酶基因表达量和尸胺含量呈极显著正相关,可见赖氨酸脱羧酶基因的表达直接影响尸胺含量的变化。(5)SaLDC密码子偏好性分析发现,该密码子偏好使用以A/T结尾的密码子,有28种偏好密码子(RSCU>1),SaLDC密码子偏好性与拟南芥最接近,与大肠杆菌差别最大;因此对SaLDC密码子进行优化,优化后的基因命名为optSaLDC,并构建重组表达载体pET-28a(+)-optSaLDC;优化后的optSaLDC在大肠杆菌中最佳表达条件为:IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导温度为15℃;获得的纯化蛋白经LC-MS/MS鉴定肽段序列覆盖度达47.30%,蛋白标准分子质量为48990.51 Da,pI 5.60,与预测结果相符,GO注释该蛋白主要生物学功能是催化赖氨酸脱羧生产尸胺。