论文部分内容阅读
第一部分p-tau (Ser262)蛋白在戊四氮点燃模型大鼠海马中的表达变化及其在海马苔藓纤维出芽中的作用研究摘要目的：检测和分析p-tau (Ser262)及其总tau蛋白在戊四氮点燃颞叶癫痫模型大鼠海马中的表达变化,并探讨其在海马苔藓纤维出芽中的作用。方法：150只6-8周龄健康雄性SD大鼠,随机分为对照组和戊四氮组,它们再随机分为3天、1周、2周、4周、6周五个时间点的亚组,采用戊四氮(30mg/kg)持续腹腔注射的方法,建立戊四氮点燃颞叶癫痫模型,相应的对照组给予生理盐水持续腹腔注射,于每个时间点取材。每次给药后至少观察2小时,并用照相仪记录大鼠发作情况,以评价造模成功与否。采用免疫组织化学法检测p-tau (Ser262)及总tau在对照组及戊四氮组各时间点大鼠海马中的表达情况；Western blot检测p-tau (Ser262)及总tau在对照组及戊四氮组各时间点大鼠海马表达量的变化；荧光定量PCR进一步验证总tau mRNA的表达变化；Timm染色检测对照组及戊四氮组各时间点大鼠海马苔藓纤维出芽动态变化。结果：1.建立了戊四氮点燃颞叶癫痫模型,取得了实验所需组织标本。2.戊四氮组免疫组化结果显示p-tau (Ser262)的表达水平除3天组外均显著增高(p<0.001),表现为1周时间点开始表达升高,随给药次数的增多表达逐渐升高,4周时达到高峰,6周时表达下降至约相当于2周时水平,而总tau蛋白在戊四氮点燃模型大鼠海马的表达与正常对照组比较无显著统计学意义。Western blot结果进一步证实了p-tau(Ser262)在戊四氮点燃模型大鼠海马中的表达变化,而荧光定量PCR亦证实戊四氮组总tau在其mRNA水平即与对照组无显著差别(p>0.05)。3. Timm染色结果显示除3天组外戊四氮组余各时间点的苔藓纤维出芽与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01),出芽程度随着给药次数的增加而升高,4周时达高峰,之后维持于该水平。苔藓纤维出芽在各时间点的程度变化与p-tau(Ser262)在癫痫大鼠海马中的表达模式呈高度一致性,提示p-tau (Ser262)在海马苔藓纤维出芽中可能发挥重要作用。结论：海马苔藓纤维出芽可能是戊四氮点燃模型大鼠痫性发作的原因。p-tau (Ser262)参与了戊四氮点燃模型大鼠颞叶癫痫的形成。p-tau (Ser262)可能参与戊四氮点燃模型中海马苔藓纤维出芽的形成。第二部分蛋白磷酸酯酶2A对戊四氮点燃模型大鼠痫性发作的作用目的：探讨调节tau蛋白磷酸化的蛋白磷酸酯酶2A (PP2A)对戊四氮点燃模型大鼠痫性发作的作用。方法：随机选取200只6-8周SD雄性大鼠,分为对照组、戊四氮组、空白对照组和硒酸钠组；对照组和戊四氮组造模同第一部分,硒酸钠组大鼠先给予硒酸钠配制饮用水进饮1周,空白对照组则给予等量正常饮用水,1周后硒酸钠组停止饮用药物配制用水,随之两组均给予戊四氮(30mg/kg)腹腔注射,于注射后第8天,硒酸钠组大鼠再次给予硒酸钠饮用水,连用4天,同时进行戊四氮注射,每次注射后观察大鼠痫性发作情况并记录；采用免疫组织化学法、Western blot及荧光定量PCR法首先检测戊四氮组大鼠海马组织中的PP2A、Methyl-PP2A的表达变化；再检测硒酸钠组及空白对照组p-PP2A大鼠海马和p-PP2A的表达变化。Methyl-PP2A结果：1.硒酸钠组大鼠的痫性发作严重程度明显下降,点燃率为25%,空白对照组点燃率为94%。2.戊四氮组的免疫组化及p-PP2A结果均显示除3Western blot天时间点外,在余时间点的表达与同时间点对照组比较差异均有统计学意义(p<0.05,p<0.01),表现为1周时间点开始表达升高,随给药次数的增多表达逐渐升高,4周时达到高峰,6周时表达下降至约相当于1周时水平,Methyl-PP2A的Western blot结果显示1周时间点表达开始下降,随给药次数的增多表达逐渐下降,4周时降至最低,6周时维持于该水平,而总PP2A蛋白在戊四氮点燃模型大鼠海马的表达与正常对照组比较无显著统计学意义(p>0.05)。3.硒酸钠激动组p-PP2A的表达水平于1周、2周及4周均较同时间点空白对照组显著下降(p<0.05),证明硒酸钠可显著增加PP2A的活性。与之相应,硒酸钠激动组Methyl-PP2A的表达量在1周、2周及4周较同时间点空白对照组显著升高(p<0.05),进一步证实了硒酸钠增加了戊四氮点燃模型大鼠海马的PP2A活性。结论：PP2A的活性下调参与了戊四氮点燃模型大鼠颞叶癫痫的发病机制。硒酸钠抑制戊四氮模型大鼠痫性发作的级别,表明PP2A的活性改变与戊四氮点燃模型大鼠痫性发作的严重程度有关。第三部分蛋白磷酸酯酶2A对戊四氮点燃模型大鼠海马苔藓纤维出芽的作用,目的：探讨蛋白磷酸酯酶2A (PP2A)对戊四氮点燃模型大鼠海马p-tau (Ser262)和苔藓纤维出芽的影响。方法：72只6-8周龄健康雄性SD大鼠,随机分为空白对照组和硒酸钠组,分别再随机分为1周、2周和4周三个亚组,造模同第二部分。利用免疫组化和Western blot检测p-tau (Ser262)在硒酸钠组大鼠海马组织中的表达变化,Timm染色检测硒酸钠组大鼠海马苔藓纤维出芽的动态变化；结果：1.免疫组化及Western blot均显示硒酸钠组大鼠海马p-tau(Ser262)表达水平于各检测时间点均较同时间点空白对照组显著下降(p<0.05)。2. Timm染色结果显示硒酸钠组大鼠海马苔藓纤维出芽程度较同时间点空白对照组显著降低(p<0.05,p<0.01)。结论：PP2A的活性下调引发tau蛋白异常过度磷酸化,促进戊四氮点燃模型中大鼠海马的苔藓纤维出芽,可能是其影响颞叶癫痫痫性发作严重程度的原因。