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【背景】近年来,结直肠癌已经成为全球癌症相关死亡的首要原因之一,结直肠癌是人类常见的消化道恶性肿瘤之一。中国是结直肠癌高发国家的其中之一。随着人们饮食结构、生存环境的改变,其发病率呈逐年上升趋势,且术后复发及转移情况不容乐观,5年生存率为50-60%。结直肠癌的发生、发展是机体不同阶段多因素、多基因变化的结果,由正常肠粘膜发展为管状腺瘤,再进展为结直肠癌的形成过程逐步演进,与癌基因激活和抑癌基因失活,以及细胞信号转导系统紊乱、细胞的无控性增殖及凋亡受抑等有密切的关系。据流行病学研究显示,我国结直肠癌发病率呈现逐年增高的趋势,而且大约20%-25%患者一经确诊即属于癌症晚期,严重威胁着患者生命安全。目前,手术疗法、化学药物疗法仍然是人结直肠癌治疗的主要方法,在结直肠癌中,国际上已有标准规范的化疗方案,分子靶向药物的应用在临床上也取得了一定程度喜人的治疗效果。然而,由于我们国家是发展中国家,受绝大多数肿瘤患者的经济条件限制,分子靶向治疗应用率并不高,以手术为主的外科治疗仍然为最主要的治疗手段。除此之外,经由手术、化疗、放疗带来的副作用严重影响患者预后,降低了患者的生活质量。在这种背景下,针对免疫系统的抗癌疗法是一种新的治疗实体肿瘤的方法。在这个新的领域,免疫系统里作为负向调节因子的免疫检查位点在抗肿瘤免疫反应领域中起着重要的作用。针对免疫检查位点阻断因子,例如抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4),程序性死亡细胞因子1(PD-1),程序性死亡细胞因子配体1(PD-L1),目前已经研发出了相应的抗肿瘤药物,在临床前期研究和临床研究中取得了可喜的成果。关于阻断PD-1和PD-L1的临床前期试验结果令人充满希望,尤其是在带有微卫星不稳定性(MSI)的结直肠癌患者中更加明显。有研究者在进一步深入的临床试验中将证实这些初步结果,并且评估这二者联合治疗方法的可行性,确认这两个生物标记物作为免疫检查位点阻断剂的效应在哪些人群中更有可能受益或更加抵抗。一些研究已经将目标聚焦于对化疗药的选择有指导意义的特异性基因,但基因检测成本昂贵,并且方法繁杂、技术要求高。而采用免疫组织化学染色方法检测结直肠癌组织中的PD-1和PD-L1的表达情况,方法简便,成本便宜,患者易于接受,将有助于我们选择免疫疗法来治疗结直肠癌患者。Ki-67是反映细胞增殖活性程度的一个常用的临床指标,在某些良恶性病变的鉴别中有重要意义。因此,本实验研究旨在采用免疫组化技术的方法,分别检测PD-1和PD-L1在结直肠癌石蜡包块组织中的表达,同时也采用细胞免疫组化、免疫荧光、蛋白印记等方法在细胞水平检测PD-L1在人结直肠癌细胞系里的表达,并探讨其在结直肠癌的诊断,以及与临床病理参数之间的关系和肿瘤增殖能力方面的意义。【目的】1.检测PD-1和PD-L1在结直肠癌组织中的表达,讨论其与临床病理特征和临床分期的关系,探讨其在结直肠癌发生和进展中的临床病理学意义。2.检测PD-L1在结直肠癌细胞系中的表达部位及特征,筛选PD-L1在基础研究中的最优细胞系。3.探讨PD-L1表达阳性的结直肠癌患者的总生存时间,及其可能存在的关系。【方法】1.用免疫组织化学的染色方法检测PD-1和PD-L1在结直肠癌组织和管状腺瘤中的表达。2.使用Western blot检测结直肠癌细胞系(HCT116、LoVo、SW480和SW620)中PD-L1的表达情况。3.应用免疫荧光法检测结直肠癌细胞系(HCT116、LoVo、SW480和SW620)中PD-L1的表达。4.用细胞免疫组织化学方法检测结直肠癌细胞系(HCT116、LoVo、SW480和SW620)中PD-L1蛋白的表达。5.随访纳入此研究对象中的5年前的结直肠癌病人50例,电话随访生存时间,分析PD-L1表达与患者总生存期之间可能存在的相关性。【结果】1.检测PD-L1的组织蜡块中:低+中分化组阳性102例,阴性34例;高分化组中阳性29例,阴性37例;差异有统计学意义(p<0.0001)。结肠癌中阳性63例,阴性31例;直肠癌中阳性67例,阴性39例;差异无统计学意义(p=0.573)。溃疡型阳性75例,阴性25例;非溃疡型阳性55例,阴性45例;差异有统计学意义(p=0.018)。浸润型阳性2例,阴性8例;非浸润型阳性表达128例,阴性表达62例;差异有统计学意义(p=0.019)。浸润深度在粘膜固有肌层内的结直肠癌组织中,阳性表达13例,阴性表达15例;浸润深度超过粘膜固有肌层内阳性127例,阴性45例;差异有统计学意义(p=0.003)。无淋巴结转移的结直肠癌患者中,表达阳性的有84例,阴性有46例;有淋巴结转移的癌组织中,阳性有46例,阴性有24例;差异无统计学意义(p=1)。2.检测PD-1的组织蜡块中:200例上述病例,阳性92例,阴性108例。在结肠癌中阳性49例,阴性45例;直肠癌患者中,阳性表达例数43,阴性63;差异有统计学意义(p=0.015)。肿瘤增殖指数Ki-67<70%阳性57例,阴性70例;肿瘤增殖指数Ki-67≥70%阳性15例,阴性58例;差异有统计学意义(p=0.001)。3.PD-L1和PD-1均表达阳性的组织蜡块中:同一组织蜡块共同表达PD-L1和PD-1与肿瘤的分化程度、分级、肿瘤肉眼观察大小有显著的组间差异,差异有统计学意义(p<0.05)。【结论】1.PD-L1和PD-1在结直肠癌组织中均有表达,肿瘤细胞中PD-L1的表达可能成为结直肠癌生物免疫疗法的潜在靶点。2.LoVo细胞中PD-L1蛋白的表达量最高,该细胞系可能成为进一步体外研究人结直肠癌生物免疫疗法较好的细胞平台。3.表达PD-L1的结直肠癌患者生存时间短,不表达PD-L1的结直肠癌患者生存时间比较长,肿瘤中PD-L1的表达有望成为结直肠癌判断预后的预测指标之一。