精子发生(spermatogenesis)包含了生物体内一个经典的干细胞系统,也是一个复杂而精细的调控过程,它包括了体细胞发育的抑制、细胞多能性的启动和全基因组表观遗传水平的重编程三个复杂的生物过程。在生物个体整个生殖过程中,通过雄性生殖干细胞(male germ line stem cells, mGSCs)这个特定的细胞群体,能够持续不断的产生高度分化的精子。雄性GSCs是一类单性能的细胞,在生物体内只供维持精子生成。因而,一般将mGSCs视为是生物体性别分化之后,精子发生的最初细胞形态；而原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)的产生,迁移和定位视为mnGSCs的起源。目前,研究者们通过分离培养,体外诱导,构建转基因细胞等多种方式对原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)以及精原干细胞(Spermatogonial Stem cells, SSCs)的生长和分化进行了研究,但关于调控雄性生殖细胞发生这一过程的信号网络知之甚少,有关生殖细胞发生和分化机制的研究成为近年来备受关注的焦点。雄性生殖细胞的分化过程受到许多内源性调控因子的调控,另外还会受到许多细胞外基质等外源因素的影响。而这些因子是通过不同的信号通路进行综合调控,构成了复杂的调控网络,能够直接地或间接地调控雄性生殖细胞的形成。随着现代高通量测序技术的全面发展,转录组测序(RNA-Seq)已成为研究全基因组基因表达规律的重要研究技术。通过本实验室前期完成的鸡雄性ESCs,雄性PGCs以及SSCs的RNA-Seq测序结果,对鸡雄性生殖细胞发生过程中的全基因组水平的转录组进行综合分析,将有助于全面系统地分析基因动态表达,查找参与调控的信号通路,并构建调控网络,为阐明生殖细胞的发生及分化机制提供有力的理论依据。通过对鸡雄性ESCs,雄性PGCs以及SSCs的RNA-Seq转录本差异基因进行的分析,实验室前期已经发现Notch信号通路以及TGF-β信号通路参与鸡雄性生殖细胞的形成过程。但是,由于雄性生殖细胞的发生及分化是通过多通路以及多基因之间综合调控的。因此,单从这两个信号通路去构建鸡雄性生殖细胞的发生及分化调控机制是远远不够的。为了进一步研究调控鸡雄性生殖细胞的发生及分化机制,本研究对鸡雄性ESCs,雄性PGCs以及SSCs的RNA-Seq转录本差异基因进行了进一步的深入分析,筛选出了另一条对雄性生殖细胞形成过程起到重要调控作用的JAK-STAT(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription)信号通路,并对该通路进行了体内和体外的功能验证；为了解决体外雄性生殖细胞分化效率较低的问题,本研究还通过悬滴培养的方法,摸索鸡ESCs形成类胚体的最佳条件；最后对不同的诱导体系进行了比较,以期为ESCs向雄性生殖细胞定向分化筛选出最佳诱导体系,为生殖细胞形成机制的阐明提供理论和实验基础。研究结果如下：(1)本研究通过对鸡ESCs-male、PGCs-male和SSCs转录组RNA-Seq检测结果,从整体转录组水平对雄性生殖细胞生成过程中基因的表达调控网络机制,进行系统、全面地分析。通过筛选差异表达基因,探讨鸡雄性生殖细胞形成过程中三种细胞的关键基因的表达变化,并利用GO分析和pathway分析对差异表达基因进行聚类分析,筛选参与调控鸡雄性生殖细胞形成过程中的关键信号通路。通过上述过程,本研究筛选出差异信号通路——JAK-STAT信号通路可能参与鸡雄性生殖细胞形成过程。为了验证RNA-Seq分析结果的可靠性,通过qRT-PCR和Microarray测序技术双向检验了RNA-Seq测序结果的可靠性。结果显示,所选基因的表达趋势在qRT-PCR, Microarray和RNA-Seq三种结果中虽然表达差异倍数上有所不同,但是变化趋势一致,验证了RNA-Seq测序结果的可靠性,说明基于RNA-Seq结果而筛选的参与鸡雄性生殖细胞分化过程的关键基因和信号通路具有可靠性和准确性。(2)将鸡ESCs培养传代至第三代,采用1×104个/mL,3R104个/mL和6×104个/mL三个细胞浓度,使用悬滴培养后观察类胚体的形成效率。并通过形态学,qRT-PCR,免疫细胞化学,核型分析以及类胚体体外自分化等方法对形成的类胚体进行检测。结果表明,在3×104个/mL的细胞浓度下,通过不含干细胞维持因子的培养液悬滴培养48h,类胚体形成数量最多,单个视野下可观察到约267个类胚体,表明3×104个/mL为鸡ESCs体外悬滴培养形成类胚体的最适浓度。能一次性获得相对较多的EB,且大小基本一致,可重复性高。对形成的类胚体进行qRT-PCR检测发现,其持续表达干性基因Nanog, Sox2, Oct4和C-kit,且免疫细胞化学检测Nanog和SSEA-1呈阳性。另外,对悬滴培养形成的类胚体进行核型分析,发现类胚体在形成过程中具有正常的核型。试验结果表明,本研究中采用悬滴培养法形成类胚体能够分化成3个胚层,可用于体外定向诱导过程。该研究建立了鸡ESCs体外悬滴培养形成类胚体的培养体系,为后期信号通路的体外验证提供试验基础。(3)取培养至2代的雄性ESCs,利用反式维甲酸(ATRA, All Trans Retinoic Acid),维甲酸类似物(Am80,Tamibarotene)以及雌二醇(E2,Tamibarotene),探索体外诱导鸡ESCs向雄性生殖细胞(MGCs)分化的效果。结果表明：ATRA诱导组,2-4d类胚体逐渐形成并增加,6-8d类胚体细胞发生解体,12d观察到生殖样细胞,成葡萄串状聚团生长；生殖细胞相关基因Cvh,C-kit,integrina6和integrinβ1的最高表达量可分别达到1.03,0.52,0.86和1.50。Am80诱导组,4-6d类胚体出现并逐渐增大,8-10d类胚体解体变为小的圆形细胞,12d观察到生殖样细胞；生殖细胞相关基因Cvh,C-kit,integrina6和integrinβ1的最高表达量可分别达到0.85,0.40,1.01和0.98。E2诱导组,2-4d类胚体出现,6-8d持续形成并逐渐增大,10d部分类胚体开始解体,少量生殖样细胞开始形成,12d观察到生殖样细胞数目增加,并呈现出聚团生长的趋势；生殖细胞相关基因Cvh,C-kit, integrina6和integrinβ1的最高表达量可分别达到0.48,0.50,1.10和1.20。自分化组生殖细胞相关基因Cvh, C-kit, integrina6和integrinβ1的表达无明显变化。结果证明,反式维甲酸(ATRA),维甲酸类似物(Am80)以及雌二醇(E2)可以作为鸡ESCs体外定向诱导分化为雄性生殖细胞的候选诱导剂。该研究为进一步优化鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的诱导体系,为进一步深入研究JAK-STAT信号通路的调控机理提供理论和试验基础。(4)取新鲜的受精鸡胚,利用JAK-STAT信号通路抑制剂Cucurbitacin I和激动剂IL6进行鸡胚注射,并设立正常孵化组和对照组,正常条件孵化。分别收集鸡胚孵化4.5 d的生殖嵴样本及19 d睾丸样本,qRT-PCR,Western blot,细胞流式分选,PAS染色,免疫组化等方法检测鸡雄性生殖细胞体内动态变化,以揭示JAK-STAT信号通路对生殖细胞的分化作用。结果表明,JAK-STAT信号通路抑制后孵化4.5d的鸡胚生殖嵴中,抑制组生殖细胞标记基因Cvh的表达量(12.34)和C-kit的表达量(14.83)与对照组相比均显著下调；孵化19d睾丸中,抑制组integrina6的表达量(30.03)和integrinβ1的表达量(36.48)与对照组相比显著下降。与此同时,流式分选检测的生殖细胞Cvh,C-kit,integrina6和integrinfβ1标记率分别下降至7.3%,12.8%,5.6%和5.3%。PAS染色和免疫组化染色结果表明,JAK-STAT信号通路被抑制后,4.5d鸡胚的性腺发育迟缓,性腺内PGCs数量减少。相反,JAK-STAT信号通路被激动后,生殖细胞标记基因Cvh和C-kit基因的表达量分别提高至15.82和16.13,流式分选检测的生殖细胞Cvh和C-kit P日性细胞率分别上升至11-3%和14.1%。PAS染色和免疫组化染色结果表明,JAK-STAT信号通路被激动后,4.5d鸡胚性腺内PGCs数量显著提高。该结果验证了JAK-STAT信号通路在鸡雄性生殖细胞体内分化过程中起到关键作用。JAK-STAT信号通路参与鸡雄性生殖细胞体内分化过程,尤其是对鸡雄性生殖细胞的早期形成具有重要调控作用。(5)取培养至2代的雄性ESCs,在RA诱导的基础上,加入抑制剂Cucurbitacin I和激动剂IL6,对JAK-STAT信号通路在鸡ESCs体外定向分化为雄性生殖细胞过程的作用进行了研究。qRT-PCR,细胞间接免疫荧光等方法检测诱导过程中关键基因和蛋白的动态表达变化,以揭示JAK-STAT信号通路对生殖细胞的体外分化过程的作用。结果表明,在RA能够成功激活生殖细胞特异表达基因C-kit, Cvh, integrina6和intergrinβ1的基础上,加入JAK-STAT信号通路抑制剂后,C-kit最高表达量仅为0.32,Cvh的最高表达量仅达到0.41；细胞间接免疫荧光检测同样显示C-kit和Cvh阳性细胞数目少于RA诱导组,RA诱导组相比C-kit和Cvh激活受到了抑制；并且在诱导期间,抑制组integrina6和intergrinβ1的表达水平均低于同一时间RA诱导下的表达水平,RA的诱导效果受到了抑制作用。相反,加入JAK-STAT信号通路激动剂后,诱导6d就出现了生殖细胞特异基因C-kit和Cvh的表达高峰,比RA诱导激活时间提前；并且integrina6和intergrinβ1的表达量分别能提高至1.60和1.65,细胞间接免疫荧光检测同样显示integrina6和intergrinβ1阳性细胞数目少于RA诱导组,JAK-STAT通路激动剂IL6促进了RA的诱导效果。该结果验证了JAK-STAT信号通路在鸡ESCs向雄性生殖细胞体外诱导分化过程中起到关键作用。