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副流感病毒5型（Parainfluenzavirus5,PIV5）是单股负链不分节段的RNA病毒,属于副粘病毒科、腮腺炎病毒属。自上世纪五十年代从猴肾细胞分离以来,又陆续从人、犬、猪、牛、等多种哺乳动物分离。PIV5在自然界多呈隐性感染,动物大多没有严重的临床症状。尽管PIV5已经被发现多年,但是有关PIV5基因组的密码子使用模式分析依旧一片空白。鉴于此,本研究从GenBank数据库收集到40余株PIV5的全基因组序列,并对其进行了一系列有关密码子及核苷酸的分析。近年来,我国有多篇关于PIV5分离株的报道,其宿主众多,包括猪、牛、犬、马、东北虎、小熊猫、穿山甲等哺乳动物,但是有关PIV5的分子生物学特性以及遗传进化分析研究较少。鉴于此,本研究制备了 PIV5 NP蛋白的单克隆抗体,完成了实验室保存的4株猪源PIV5毒株的全基因组测序,发现其含有SH基因,这是中国猪源PIV5毒株所独有的,其他国家的猪源PIV5毒株因突变等导致SH基因无法正常表达。进一步生物学特性研究表明,中国猪源PIV5毒株在IPEC-J2、PIG-PAM细胞上生长状况良好,且几乎不产生病变。本研究首次了构建了猪源PIV5的全长感染性克隆,并将其SH基因替换为EGFP基因,建立了稳定的PIV5拯救平台,为以PIV5作为基因工程疫苗载体的研究和病毒的基因功能研究奠定了一定的基础。通过对重组病毒的初步探究,发现PIV5可能通过SH拮抗IRF3的表达,以起到抗宿主细胞凋亡的作用。1、PIV5毒株序列分析和进化分析将实验室保存的 4 株猪源 PIV5 毒株（HLJ2015/DP1-1/PIV5、HLJ2015/DP2-1/PIV5、HuB/YC/2015/PIV5、JX/2015/1221/PIV5）分别感染 Vero 细胞,经过 RT-PCR 以及 IFA鉴定后,扩增其全长并克隆至pMD19-T载体以完成全基因组测序（4株猪源PIV5毒株的 GenBank 登录号分别为 MT890696、MT890697、MT890699、MT890700）。序列分析结果显示,4株猪源PIV5毒株的基因组长度均为15246nt,遵循“六碱基原则”,且其结构均按照3’UTR-NP-V/P-M-F-SH-HN-L-5’UTR排列。同源性分析结果表明,4株猪源PIV5毒株之间的核苷酸同源性为99.9%～100.0%,与中国猪源SH-1202株亲缘关系最为接近,进一步充实了国内PIV5基因组数据信息,为国内PIV5的流行病学监测提供参考资料。密码子偏好性研究常用于研究不同毒株间的进化关系以及病毒的基因组特性。因此,本研究搜集到40余株PIV5全基因组序列,并应用生物信息学软件对可利用的PIV5-ORF序列进行密码子使用模式分析。结果表明,PIV5-ORF富含AU序列,核苷酸的使用方式上存在偏好性。PIV5-ORF的密码子使用模式受到自然选择、突变压力与二核苷酸丰度的影响。这些研究结果进一步阐明了 PIV5的基因组特性,为研究PIV5的进化方式提供一定的参考。2、不同PIV5毒株的生长特性研究及单抗制备将本研究所涉及的4株猪源PIV5毒株,以及实验室保存的牛源BC-14株、小熊猫源 ZJQ-221 株、猪源 SH-1202 株感染 MDBK、MDCK、Vero、IPEC-J2、LLC-PK1、PIG-PAM、PK-15、ST、ST-R、STIRF3 KO、STMX1KO、STRIG-IKO 等细胞系（后 9 种细胞系为猪源细胞系）,发现猪源PIV5毒株可以在牛源、犬源细胞系上生长;与其他国家报道的猪源PIV5毒株相比,中国猪源的PIV5毒株能够表达SH基因,在IPEC-J2、PIG-PAM细胞上生长状况良好;猪源PIV5毒株在天然免疫基因缺失细胞系上的滴度高于在非缺失细胞系上的滴度,提示猪源PIV5毒株受猪源细胞系干扰素影响较大。PIV5 NP基因遗传进化高度保守,较为稳定,且在病毒的感染早期就可以检测到NP蛋白。故本研究针对NP蛋白,选择其亲水性较好的区域,利用原核表达系统表达截短的NP蛋白,通过一系列的纯化步骤得到高纯度、高浓度的NP重组蛋白。将纯化后的蛋白免疫小鼠,挑取多抗血清IFA鉴定结果呈强阳性的小鼠脾淋巴细胞与杂交瘤细胞融合,再通过阳性筛选以及亚克隆获得能够稳定分泌特异性针对PIV5 NP蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。后续实验结果表明,该腹水单抗能特异性识别PIV5 NP蛋白,适用于IFA、Western Blot等实验。PIV5NP蛋白单克隆抗体的制备,为PIV5的鉴定提供了便捷,也为PIV5分子生物学研究奠定了基础。3、PIV5感染性克隆构建及重组病毒鉴定本研究通过酶切连接和同源重组的方式,首次构建了猪源PIV5毒株的全长感染性克隆,并将其SH基因替换为EGFP基因。在强大的T7启动子以及辅助质粒的作用下,于BHK-21细胞完成了病毒的拯救,建立了能够稳定拯救PIV5的平台。通过研究重组病毒的生物学特性,发现SH缺失株与亲本株的生长特性相似,表明SH是外源基因的一个优良插入位点。进一步的研究表明全长感染性克隆病毒在缺失SH基因后,ST细胞TNF-α的表达水平有明显提高。