选题依据:抑郁症是一种常见的精神疾病,以持续情绪低落和认知功能障碍为主要临床特征,也是发病涉及多种机制的复杂病症。目前,临床上使用的抗抑郁西药可以改善抑郁症状,但很难取得全面效果,基于中药及其复方研发抗抑郁新药成为研究的热点。课题组前期以经典方剂逍遥散为研究对象,对其进行体内和体外药理活性以及血清药化研究,发现君药柴胡对其发挥抗抑郁作用有着较大的贡献。柴胡,作为使用频率最高的抗抑郁药,前期研究表明柴胡石油醚部位具有良好的抗抑郁作用,但并未通过药理实验对柴胡进行最佳药效部位的筛选。药物通过口服吸收进入血液后,通过血液循环运输到各个靶器官才能发挥药效。脑是抑郁症重要靶器官,药物若能通过血脑屏障说明其可能入脑直接发挥药效,另外,机体病理状态不同可能也会影响药物体内过程。因此,本研究拟探讨在不同机体状态下柴胡抗抑郁活性部位给药后大鼠血中移行成分的体内代谢特征及药代动力学行为的差异,不同脑区中化学成分和含量的差异以及血脑屏障通透性的改变,为抗抑郁新药的研发提供参考。目的:明确柴胡的抗抑郁活性部位,阐明其在不同机体状态下血中移行成分的体内代谢特征及药代动力学行为的差异,探寻到达脑组织的化学成分的差异,并研究活性部位对血脑屏障通透性的影响,通过上述研究综合评价柴胡活性部位的体内过程,对药物发挥药效和药物在体内的代谢提供科学依据。方法:1.将SD大鼠随机分为空白组(K)、CUMS模型组(M)、阳性药盐酸文拉法辛(PC,35 mg/kg)组、柴胡石油醚低极性部位(B,15 g/kg)组、柴胡乙酸乙酯中极性部位(BE,15 g/kg)、柴胡水提物高极性部位(BW,15 g/kg)组。通过测定行为学指标和血清中神经递质的含量,比较柴胡低、中、高极性部位对大鼠体重、糖水、旷场等行为学指标以及血清中9种神经递质的影响,筛选柴胡抗抑郁最佳活性部位。2.取K组和M组大鼠,分别灌胃给予柴胡石油醚部位(50 g/kg)后,分别于0h、1 h、1.5 h、2.5 h、12 h收集血清样品,采用UHPLC-Q Exactive Orbitrap-MS高分辨质谱技术结合Compound discover 3.0分析软件对血清中的原型化合物及柴胡多炔和柴胡皂苷的代谢物进行深度表征,并比较不同机体状态下入血成分种类与浓度的差异。3.取K组和M组大鼠,分别灌胃给予柴胡石油醚部位(50 g/kg)后,于0、0.08、0.16、0.33、1、2.5、4、6、9、12、24、36、48 h收集血清样品。采用代谢组学技术,分析空白组、模型组、模型给药组不同给药时间点大鼠血清的内源性代谢轮廓差异,通过相对距离值寻求药效最佳的时间点,再根据VIP>1、?pcorr?>0.58以及独立样本T检验P<0.05,识别与疾病和药效相关的差异代谢物,并用ROC曲线评价差异代谢物的诊断性能。采用UHPLC-Q Exactive Orbitrap-MS分析技术,通过热图分析比较不同机体状态下化学成分的药代动力学行为,通过聚类分析将模型组中外源性化合物分类,同时利用相对距离值作为药效指标,与模型组的药代动力学数据进行相关性分析,寻找与药效相关的潜在药效成分群和药代标志物,最后进行PK-PD结合分析,揭示药动-时间-药效三者之间的关系。4.将大鼠随机分为空白组K组、M组、空白给药组(PK组,50 g/kg)、模型给药组(PM组,50 g/kg),对PK、PM组单次给药12h后海马、皮层、纹状体、下丘脑、垂体组织中的化学成分进行表征,并比较不同机体状态化学成分的种类和含量的差异。5.将大鼠随机分K组、M组、空白给药柴胡石油醚部位(CK,50 g/kg)组、模型给药柴胡石油醚部位(CM,50 g/kg)组,大鼠造模的同时灌胃给药28天,采用免疫组化的方法,对海马,前额叶皮层,纹状体,下丘脑,垂体的血脑屏障结构相关蛋白ZO-1、AQP4、CX43的表达进行测定,采用RT-qPCR技术对功能屏障相关基因MDR1、BCRP、MRP1的表达水平进行测定,比较不同机体状态下,柴胡石油醚部位对不同脑区血脑屏障结构和功能的影响。结果:1.与空白组相比,模型组体重、糖水偏爱率、水平穿越格数显著降低(P<0.01,P<0.001),血清中Trp、5-HT、GABA、GABA/Glu、Tyr的水平明显降低(P<0.05,P<0.01),表明CUMS造模成功。比较柴胡不同极性部位的行为学指标,结果表明柴胡不同极性部位均可改善CUMS大鼠的抑郁样行为,其中柴胡低极性部位的抗抑郁效果最强。比较柴胡不同极性部位血清中神经递质的水平,结果表明柴胡不同部位在神经递质调节具有各自的特点,柴胡低极性部位的神经递质水平更接近空白组,药效最强。综合以上行为学与神经递质结果,本研究选择抗抑郁活性最强的柴胡石油醚低极性部位进行进一步深入研究。2.通过对柴胡石油醚部位进一步的分离纯化,分离鉴定出两种多炔类化合物RB-9、RB-10,其中RB-9为新的化合物。利用UHPLC-Q Exactive Orbitrap-MS技术对空白给药大鼠和模型给药大鼠血清样品进行分析,共检测出70种原型化合物(C1-C70)和201种代谢物(M1-M50、MA1-MA14、MB1-MB14、MC1-MC15、MD1-MD15、MS1、MS2),其中原型化合物包括26种文献报道的已知化合物、26种未知多炔类原型化合物,1种未知次皂苷类似物,17种未知原型化合物,代谢物包括148种多炔类代谢产物、3种柴胡皂苷类代谢物,50种其他代谢物未推测出结构。另外,比较不同机体状态下药物吸收种类与浓度的差异,发现药物在体内的吸收和代谢存在一定的差异。生理状态下,血清中检测了248个化合物,其中69个原型化合物,179个代谢物;CUMS病理状态下,血清中检测了239个化合物,其中51个原型化合物,188个代谢物,其中1种原型化合物和22种代谢物仅在模型给药组血清样品中检测到。3.单次灌胃给予柴胡石油醚部位后,对于内源性化合物,采用代谢组学技术,比较正常组和模型组以及模型给药后不同给药时间点大鼠血清的内源性代谢轮廓,结果表明模型给药后4h、6h、9h血清的代谢轮廓更接近空白组,药效更好,且药效强弱:M6h>M9h>M4h。通过建立数学模型,以相对距离值作为效应指标来反映内源性化合物在体内不同时间点的整体变化。此外,将模型血清分别与空白血清,模型给药后4h、6h、9h血清的内源性化合物进行多元统计分析,筛选鉴定出鞘磷脂、鞘氨醇、L-棕榈酰肉碱等与药效相关的20种内源性差异代谢物,且与鞘脂代谢通路有关。通过ROC曲线分析得到20种差异代谢物的AUC均大于0.7,有望成为抑郁症诊断的标志物。对于外源性化合物,通过热图分析,发现不同机体状态下的化合物的药动曲线存在明显的差异;通过聚类分析,将模型组的化合物分为6类化合物;这6类化合物与药效指标(相对距离值)进行相关分析,结果表明第六类化合物与药效呈正相关,相关性最强,为潜在的药效成分群。相关系数大于0.4的第一类化合物C38、C68,第六类化合物C12、C61、MA3-3、MB1-4、MC13-4、MD15-2、M4、M35、M43为外源性药代标志物。CUMS抑郁大鼠整合PK-PD结合模型研究表明,第一类、第二类、第三类、第四类化合物药物效应和血药浓度存在明显的滞后现象,第五类、第六类化合物达峰时间较慢,推测可能是柴胡石油醚部位中不同成分的体内过程不同,发挥活性的靶点不同,各成分可能通过协同作用使药效持续的时间更长,作用更全面。4.单次灌胃给予柴胡石油醚部位12 h后,考察药物进入不同脑区的化合物种类和相对含量,并比较在正常大鼠与CUMS模型状态下吸收入脑的化合物的种类与量的差异。结果表明,柴胡石油醚部位给药后在脑内主要以代谢物的形式存在,且在不同机体状态下,进入不同脑区中化学成分的数量和相对含量有所不同。数量上海马和皮层中药物成分最多,纹状体和垂体组织最少。在生理和病理状态下D类多炔代谢物均易通过血脑屏障进入不同脑区。此外,在生理状态下,B类多炔类代谢物易通过血脑屏障进入海马、皮层、纹状体、下丘脑组织,C类多炔类代谢物易通过海马、皮层组织;在病理状态下,C类多炔类代谢物易进入海马、纹状体组织,B类多炔类代谢物易通过皮层组织。相对含量上,在生理状态下,化合物在纹状体和下丘脑中吸收较多,各脑区含量较高的化合物可能通过相互作用,保护血脑屏障内环境的稳态;在病理状态下,化合物在海马和皮层组织中吸收较多,各脑区含量较高的化合物可能是发挥抗抑郁药效的物质基础;而在不同机体状态下,垂体组织中化合物的吸收差异不明显,垂体组织中独有的化合物可能对脑组织的保护和药效的发生具有重要作用。5.灌胃给予柴胡石油醚部位28天后,采用免疫组化的方法,对不同脑区的的结构相关蛋白AQP4、CX43、ZO-1的表达进行测定,同时运用RT-qPCR技术,对其功能屏障相关基因MDR1、BCRP、MRP1的表达水平进行测定。结果表明,与K组比,M组海马、皮层组织中AQP4、CX43的表达显著降低(P<0.05,P<0.01),纹状体组织ZO-1的表达显著降低(P<0.05),下丘脑组织AQP4、ZO-1的表达显著降低(P<0.05),表明CUMS造模使海马、皮层、纹状体、下丘脑组织血脑屏障损伤,血脑屏障通透性增加。同时海马、皮层、纹状体、下丘脑组织的外排转运基因的表达升高,使其血脑屏障的功能屏障增强。给予CUMS模型大鼠柴胡石油醚部位后,CM组海马、皮层、纹状体、下丘脑组织中结构相关蛋白的表达都有不同程度的回调,使血脑屏障通透性降低,改善血脑屏障损伤。外排转运蛋白的表达显著降低,使药物选择性地进入脑内发挥作用。与K组比,CK组海马组织MDR1的表达显著升高,皮层AQP4的表达显著升高,MRP1的表达显著降低,纹状体AQP4、CX43、ZO-1的表达显著升高,下丘脑CX43的表达显著升高,以维持脑内环境的稳态。本研究中,垂体组织在造模与否、给药前后结构相关蛋白的表达均无显著性差异,空白大鼠给药后BCRP的表达显著升高,来保护内环境稳态。结论:通过以上研究,本论文筛选出了柴胡的最佳活性部位为柴胡石油醚部位。并系统地表征了不同机体状态下灌胃给予柴胡石油醚部位后血中移行成分的异同,进一步对这些化合物进行药代动力学研究,同时在明确内源性差异代谢物的情况下进行药效动力学研究,进行相关性研究阐明药动-时间-药效之间的关系,最后揭示了脑组织中入脑成分及药物对血脑屏障的影响,本研究为揭示石油醚体内过程及抗抑郁机制提供依据。