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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,又叫“猪蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种烈性传染病,在临床上主要表现妊娠母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道症状。现今猪场PRRSV多类型毒株感染较为普遍,主要有PRRSV疫苗毒株、野毒株、重组毒株和类NADC30毒株,毒株的多样性使得对该病的防控举步维艰。迄今为止,PRRSV已经在我国流行二十几年,但仍然未得到有效的控制,给我国生猪业的发展带来了难以估计的经济损失。本试验从疑似PRRSV感染的猪场分离并鉴定2株PRRSV毒株,进行全基因序列分析,在mRNA水平探究PRRSV贵州分离株对解旋酶DDX6、Mov10的影响。为初步了解贵州局部地区PRRSV感染以及毒株变异情况提供参考,也为进一步研究解旋酶DDX6、Mov10与PRRSV增殖的关系奠定基础。1.PRRSV贵州分离株GZZJ11、GZBJ12的分离与鉴定。试验对疑似PRRSV感染猪的脏器组织进行PRRS病毒分离与鉴定。取病料进行研磨、离心、除菌过滤处理后,接种于Marc145细胞,进行病毒分离;通过CPE观察、RT-PCR、IFA和Western blotting等方法对分离病毒进行鉴定。结果表明:（1）GZZJ11株在Marc145细胞上盲传至第6代后能观察到Marc145细胞出现聚团、皱缩等明显CPE,GZBJ12盲传至第3代后也能观察到相同CPE。（2）在分离病毒GZZJ11株和GZBJ12株分别盲传第6代、第3代时,RT-PCR检测到与预期相符的372 bp的N基因条带,以及931 bp的NSP2基因条带。（3）用基因2型PRRSV抗N蛋白的兔源多抗进行IFA和Western blotting试验鉴定分离毒,IFA结果显示感染病毒组能看到特异性的绿色荧光;Western blotting结果表明PRRSV感染组在15 kDa处出现特异性条带,未感染组无特异性条带。（4）GZZJ11第6代细胞培养物的TCID50值为10-2.2/0.1 mL,GZBJ12第3代细胞培养物的TCID50为10-4.67/0.1 mL。结果表明本试验成功分离鉴定出2株PRRSV,并命名为GZZJ11和GZBJ12,为后续进一步研究PRRSV相关特性奠定基础。2.PRRSV贵州分离株GZZJ11、GZBJ12全基因序列分析。采用PrimerSelect软件针对PRRSV的全基因保守区域设计13对引物,分别对2株毒株的13个基因片段进行RT-PCR、克隆至pMD-19T载体、测序、拼接,得到2株PRRSV毒株的全基因序列（去除polyA尾）,采用Lasergene软件包、MEGA7.0对2株毒株的全基因序列进行比对分析。（1）RT-PCR检测到与预期大小基本相符的13个基因目的条带;拼接后分别获得GZZJ11和GZBJ12毒株全长基因组序列为15323 bp、14963 bp;全基因核苷酸比对结果表明2株毒株的全基因序列与基因1型毒株同源性在60%左右,与基因2型毒株同源性在82%以上,与HP-PRRSV代表株JXA1、HUN4、TJ核苷酸同源性在98.8%99.2%之间。（2）2株毒株非结构蛋白和结构蛋白基因变异分析结果表明NSP2、NSP9、ORF3、ORF4和ORF5基因均有不同程度的变异,其中NSP2基因变异最大。GZZJ11株和GZBJ12株的NSP2基因分别有24、23个氨基酸突变,均有1+29个氨基酸不连续缺失,缺失位置与HP-PRRSV缺失位置一致。GZBJ12株NSP2基因除了有30个不连续氨基酸缺失外,在下游还存在120个氨基酸连续缺失,提示GZBJ12株可能演变于HP-PRRSV TJ致弱疫苗毒株TJM。（3）毒力位点分析结果表明2株毒株位于ORF5的毒力位点151位氨基酸发生了相应突变,这一位点的突变与我国分离的类NADC30毒株CHsx1401、FJXS15毒株突变一致,也与新分离的TJnh1501、GDHY、XJu-1毒株的毒力位点相同。（4）基于NSP2、ORF5以及全基因核苷酸序列遗传进化树结果表明GZZJ11株与TJnh1501、HENZZ-8等基因2型毒株遗传进化关系较近,GZBJ12株与GDHY、XJu-1等基因2型毒株遗传进化关系最近,这与全基因核苷酸序列同源性分析结果基本一致。试验结果为初步了解贵州局部地区PRRSV感染以及毒株变异情况提供参考。3.PRRSV贵州分离株GZZJ11、GZBJ12对解旋酶DDX6、Mov10的影响。通过RT-PCR从Marc145细胞中扩增DDX6、Mov10基因CDS区,并对DDX6基因CDS区进行克隆和生物信息学分析;利用q-PCR方法在mRNA水平检测贵州分离PRRSV在不同时间段感染Marc145细胞后对解旋酶DDX6和Mov10基因的影响。结果表明:（1）Marc145细胞源DDX6基因CDS全长1452 bp,编码483个氨基酸;DDX6蛋白有四个基序,含有DEAD-like解旋酶超家族结构域和C端结构域;二级结构主要以α-螺旋（37.27%）和无规则卷曲（36.44%）为主;同源性及系统进化树分析结果表明Marc145细胞源与人DDX6核苷酸同源性最高,亲缘关系最近。（2）q-PCR结果表明2株PRRSV感染Marc145细胞6 h后DDX6基因mRNA水平升高,在36 h时段差异显著;PRRSV感染Marc145细胞0 h、6 h、36 h和72 h时段Mov10基因转录水平下降,其它时段Mov10基因转录水平升高。说明贵州分离株PRRSV对解旋酶DDX6、Mov10转录水平具有一定影响。试验为进一步探究解旋酶DDX6、Mov10与PRRSV增殖的关系提供了参考。