射频消融(RadiofrequencyAblation，RFA)治疗是局部热疗的一种，其通过电极激发邻近组织中的离子运动并产生大量的离子热，从而导致局部的高温和凝固性坏死，近年，RFA被广泛地应用于肝内肿瘤的治疗并在小肝癌取得了与手术切除相当的近期和中远期疗效，且RFA具备创伤小，副作用小和重复性好的特点，但术后复发及治疗不完全导致的肿瘤残存仍是影响其疗效和临床应用的主要原因，因此，在RFA治疗中进一步激发、增强机体对肿瘤的主动免疫反应，有可能在延缓肿瘤生长、杀灭体内微小残留病灶或转移病灶，防止术后复发、转移方面起重要作用。 以树突状细胞(Dendritic Cell，DC)瘤苗为代表的生物治疗是近年肿瘤治疗的另一热点。由于DC具有强大的外来抗原识别、摄取和递呈的能力，能激活机体抗肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞反应和刺激B淋巴细胞使其产生特异性抗体，因此，DC在机体抗肿瘤免疫中起着必不可少的作用。 然而DC在体内的含量甚微，且大量的研究表明，肿瘤细胞通过干扰DC的正常分化、成熟，或通过一些可溶性因子导致DC表面的MHC—Ⅰ、MHC—Ⅱ类分子或共刺激分子的表达及功能受抑制，使其不能正常识别和提呈肿瘤抗原，从而不能激发有效的机体抗肿瘤免疫方应，肿瘤因而可以“逃避”机体的免疫机制得以生长。 本研究拟在应用RFA治疗肿瘤后联合应用热休克冻融抗原致敏DC瘤苗或冻融抗原致敏DC瘤苗回输至荷瘤机体，探讨联合治疗的疗效及对机体免疫状态的影响，以讨论其临床应用的可能性。 研究目的 1．在RFA治疗后，利用负载不同抗原的DC瘤苗治疗大鼠实体瘤，探讨经不同处理肿瘤抗原致敏DC联合RFA治疗对疗效的影响。 2．通过检测治疗前后大鼠外周血中CD4+T胞和CD8+T细胞水平及CD4+／CD8+比值的变化，探讨负载不同抗原DC瘤苗联合RFA治疗大鼠实体瘤对大鼠免疫机能的影响。 材料与方法 一、实验采用动物、细胞株及主要试剂同第一部分，射频仪采用：Radionics单极冷循环射频治疗仪。超声仪：百胜Technos DU8彩色多普勒超声仪。 二、动物模型的建立：80-100 g体重的SD大鼠经腹腔接种walker 256细胞悬液后5-7天可获腹水型Wlalker 256肿瘤模型(种鼠)；SD大鼠腋窝经皮下接种Walker 256肿瘤腹水，5天后可获大鼠实体瘤肿瘤模型(实验鼠)。 三、大鼠骨髓来源DC的分离、培养与鉴定、抗原的制备及DC疫苗的制备方法同第一章。 四、实验方法： 1．实验分组：58只成瘤大鼠随机分成5组： ①单纯射频组，n=10：仅接受射频消融治疗； ②单纯热休克冻融抗原致敏DC组，n=10：仅接受热休克冻融抗原致敏的DC治疗； ③射频+未致敏DC组，n=10：射频治疗后，联合未致敏DC治疗； ④射频+冻融抗原致敏DC组，n=10：射频治疗后，联合冻融抗原致敏．DC治疗； ⑤射频+热休克冻融抗原致敏DC刺激组，n=18：射频治疗后，联合热休克冻融抗原致敏DC治疗； 2．实验方法： (1)射频治疗：超声引导下以裸露端20 mm电极沿病灶长轴穿刺，射频输出功率60 W，治疗时间2 min。 (2)免疫治疗：收集未致敏或不同抗原致敏的DC，射频治疗后在肿瘤附近皮下接种不同的DC瘤苗，注射细胞数为1.0×10<6>个，单纯射频组在肿瘤附近同样方法皮下注射等量生理盐水。 五、疗效观察 1．治疗前及治疗后第1、2、3天行超声检查，测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，并在各组间进行比较。记录各组大鼠荷瘤生存期，绘制生存曲线。 2．大鼠免疫机能检测：治疗前、后，经流式细胞仪检测大鼠外周血CD4+和CD8+T细胞水平，并计算CD4+／CD8+比值。 3．治疗后取右侧腋窝肿瘤，行常规HE染色病理检查。 结果 1．动物模型：腹水型Walker 256大鼠模型成瘤率80％(16／20)， Walker 256大鼠实体瘤成瘤率92.9％(65／70)。 2．肿瘤大小及生长：治疗前各组的实体瘤体积大小差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后第1、2、3天测量热休克冻融抗原致敏DC组平均瘤体体积均显著小于其他组(P<0.05)，单纯射频组、单纯热休克冻融抗原致敏DC治疗组及射频+未致敏DC组平均瘤体体积间差异无统计学意义，射频+冻融抗原致敏DC组在治疗后第1天平均瘤体体积与单纯射频组、单纯热休克冻融DC治疗组及射频+未致敏DC组无显著差异，但在治疗后第2、3天测得平均瘤体体积显著小于后3组(P<0.05)。 3．大鼠荷瘤生存期：平均荷瘤生存期：单纯射频组：9.0±1.4 d，热休克冻融抗原致敏DC治疗组：9.04±1.7 d，射频+未致敏DC组：9.1±1.8 d，射频+冻融抗原致敏DC组：13.1±2.8 d，射频+热休克冻融抗原致敏DC组：16.6±5.4 d。射频+热休克冻融抗原致敏DC组和射频+冻融抗原致敏DC组大鼠荷瘤生存期显著长于其他3组(P<0.05)，而前者的大鼠荷瘤生存期又较后者的明显延长(P<0.05)，其他3组的大鼠荷瘤生存期无明显差异(P>0.05)。 4．病理学检查：HE染色，光镜下观察可见：各组均可见肿瘤内部局部坏死，肿瘤组织内可见较多炎症细胞浸润，其中射频+热休克冻融抗原致敏DC组和射频+冻融抗原致敏DC组可见肿瘤内大量淋巴细胞浸润。 5．大鼠的免疫状态：各组大鼠治疗前后CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD4+／CD8+比值如下： (1)单纯射频组：治疗后荷瘤大鼠外周血中CD4+T淋巴细胞增加，CD8+T淋巴细胞减少，CD4+／CD8+比值升高，免疫状态有所改善。 (2)单纯热休克冻融抗原致敏DC组：大鼠治疗后其外周血CD4+T淋巴细胞和D8+T淋巴细胞均呈下降改变，CD4+／CD8+比值降低，免疫抑制状态仍然继续。 (3)射频+未致敏DC组：荷瘤大鼠外周血CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞均呈下降改变，CD4+／CD8+比值降低，免疫抑制状态没有得到改善。 (4)射频+冻融抗原致敏DC组：荷瘤大鼠外周血中CD4+T淋巴细胞增加，而CD8+T淋巴细胞减少，CD4+／CD8+比值明显升高。 (5)射频+热休克冻融抗原致敏DC组：荷瘤大鼠外周血中CD4+T淋巴细胞明显增加，而CD8+T淋巴细胞显著减少，CD4+／CD8+比值明显升高。 (6)治疗前后各组大鼠外周血CD4+T细胞的差值：射频+热休克冻融致敏DC组中CD4+T细胞的升高与其他四组相比有统计学意义(P＜0.05)；射频+冻融抗原致敏DC组其CD4+T细胞的升高较①、②、③三组比明显，与单纯射频组间差异无统计学意义，而与后两组比差异显著(P＜0.05)。　　 (7)治疗前后各组大鼠外周血CD8+T细胞的差值：治疗后各组荷瘤大鼠外周血中CD8+T细胞均呈下降改变，其中，下降的幅度南大到小依次为：射频+热休克冻融抗原致敏DC组＞射频+冻融抗原致敏DC组＞单纯射频组＞单纯热休克冻融抗原致敏DC组或射频+未致敏DC组(P＜0.05) (8)治疗前后各组大鼠外周血CD4+/CD8+比值的差值：射频+热休克冻融致敏DC组＞射频+冻融抗原致敏DC组或单纯射频组＞单纯热休克冻融致敏DC组或射频+未致敏DC组(P＜0.05)。 结论 1．Walker 256细胞株接种大鼠腹腔及腋下可以获得腹水型和实体瘤型大鼠肿瘤模型，操作简便，成癌率高，保存方便，为研究提供了方便可用的动物模型。 2．热休克冻融抗原致敏DC和冻融抗原致敏DC联合RFA治疗大鼠实体瘤，可在一定程度上减缓肿瘤生长速度，延长荷瘤大鼠生存期，其中以热休克冻融抗原致敏DC+RFA的效果为佳。 3．热休克冻融抗原致敏DC和冻融抗原致敏DC联合RFA治疗可使荷瘤大鼠外周血CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值升高，使CD8+T细胞下降，在一定程度上改善了机体的免疫抑制状态，增强了机体的抗肿瘤免疫机能，有望在治疗RFA残存肿瘤和预防治疗后复发上发挥一定作用，其中以热休克冻融抗原致敏DC+RFA的作用明显。 全文结论 1．经体外诱导分化大鼠骨髓造血干细胞可以成功地获得大鼠DC，热休克冻融抗原及冻融抗原致敏DC后可以诱导DC成熟，并有效地刺激T细胞增殖和诱导出特异性的细胞毒杀伤效应，以热休克处理后肿瘤抗原致敏DC明显。 2．热休克冻融抗原致敏DC和冻融抗原致敏DC联合RFA治疗大鼠实体瘤，可在一定程度上减缓肿瘤生长速度，延长荷瘤大鼠生存期，其中以热休克冻融抗原致敏DC+RFA的效果为佳。 3．热休克冻融抗原致敏DC和冻融抗原致敏DC联合RFA治疗可在一定程度上改善荷瘤大鼠的免疫抑制状态，进一步提高机体的抗肿瘤免疫机能，以前者作用显著，有望在治疗RFA残存肿瘤和预防治疗后复发上发挥一定作用。