【摘 要】
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本研究将纳米酶与表面分子印迹技术结合,在具有超顺磁性和过氧化物酶催化活性的四氧化三铁纳米粒子（Fe3O4 nanoparticles,Fe3O4 NPs）表面修饰了对诺氟沙星（Norfloxacin,NOR）有选择特异识别的分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymers,MIPs）,得到兼具各自优点的磁分子印迹纳米粒子（Magnetic molecularly imp
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本研究将纳米酶与表面分子印迹技术结合,在具有超顺磁性和过氧化物酶催化活性的四氧化三铁纳米粒子（Fe3O4 nanoparticles,Fe3O4 NPs）表面修饰了对诺氟沙星（Norfloxacin,NOR）有选择特异识别的分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymers,MIPs）,得到兼具各自优点的磁分子印迹纳米粒子（Magnetic molecularly imprinted polymers nanoparticles,MMIPs NPs）,也称磁仿生抗体。基于MMIPs NPs的超顺磁性、特异吸附性和过氧化物酶催化特性,建立了一种简单、快速、比色检测动物源性食品中NOR残留的新方法。主要研究内容与结果如下:（1）应用本实验室研发的制备方法,在磁性Fe3O4 NPs表面,修饰了对NOR具有高效吸附的MIPs,得到MMIPs NPs。采用催化过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）的方法,验证了Fe3O4NPs具有优异的过氧化物酶催化活性。探究了Fe3O4 NPs表面修饰对其活性的影响,发现随着表面修饰层增加,其催化活性逐渐降低,催化活性大小依次为Fe3O4NPs＞Fe3O4@NH2 NPs＞MMIPs NPs。吸附动力学试验表明在15 min时,MMIPs NPs对NOR的吸附效率达到100%。催化活性验证试验表明MMIPs NPs具有良好的过氧化物酶活性,当吸附了NOR,其催化活性会明显受到抑制,导致吸光度值降低,验证了MMIPs NPs比色法检测NOR的可行性。（2）通过MMIPs NPs催化氧化底物TMB、邻苯二胺（o-Phenylenediamine,OPD）和2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-Azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS）显色的吸光峰强度,选择了显色效果好和安全性高的TMB,其检测波长为652 nm。优化试验条件的结果表明以HAc-Na Ac为缓冲液（0.2 M,p H=3.5）,p H为3,H2O2浓度为0.1 M,TMB与H2O2体积比为1:4,反应时间为4 min,MMIPs NPs具有优异的催化性能。重复使用性试验表明MMIPs NPs经6次显色循环,催化活性仍保持在86%以上,说明其具有良好的稳定性。此外,动力学试验表明,MMIPs NPs和Fe3O4@NH2 NPs对底物TMB的亲和力均大于H2O2,与辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）和部分纳米材料相比,其对两种底物的Km更小,说明这两种纳米材料相比于HRP等对底物亲和力更强,过氧化物酶活性较强,但其催化反应速度不如HRP。（3）基于MMIPs NPs富集分离和过氧化物酶活性,建立了原位检测NOR的比色分析法。构建了NOR浓度与吸光度差值（?A,空白吸光度值减去样品吸光度值）之间的线性关系曲线,该方法的线性浓度范围为10～300 ng/m L,线性回归方程为y=0.000947x+0.03176（R~2=0.9878）,检测限为8.90 ng/m L。三个不同品牌牛奶、鸡蛋和猪肌肉样品经ELISA试剂盒（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和本方法均未检出NOR。分别采用ELISA试剂盒和本研究所构建的比色法对实际样品进行了加标回收试验,结果表明,该比色法对所检样品的加标回收率范围在75.97～95.81%之间,相对标准偏差（Relative standard deviation,RSD）在2.10～9.88%之间。ELISA试剂盒的加标回收率范围在81.27～98.89%之间,RSD在1.79～7.94%之间。综上所述,本研究建立的动物源性食品中NOR残留的比色分析法,虽然准确度有待进一步提高,但该方法将样品前处理与直接检测相结合,简化了前处理步骤,缩短了检测时长,成本低,操作简单,实现了动物源性食品中NOR的痕量检测,具有实际应用潜力。
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