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目的:1.观察健脾补肾解毒方治疗骨髓增生异常综合征(MDS)患者的临床疗效。2.通过观察调节性B细胞(Breg)、细胞因子IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、探索Breg/KIR免疫异常在MDS发病中的致病作用及“劳毒致病”的免疫学内涵。3.通过观察健脾补肾解毒方联合西医治疗前后细胞因子IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ表达水平变化及杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)与疗效相关性分析,探讨健脾补肾解毒方治疗MDS可能的作用机制。方法:1.临床观察:按照纳排标准收集MDS患者45例,数字表法随机分为中西医结合治疗组30例,西药治疗对照组15例。其中中西医结合治疗组正虚毒蕴型17例,毒盛正虚组13例,对照组采用西医常规方法治疗,治疗组在对照组治疗基础上加用健脾补肾解毒方随证加减。所有患者均治疗3个月为1疗程,观察2个疗程以上进行临床评价,观察治疗前后血常规细胞计数、西医临床疗效、中医证候积分、中医证候改善情况和感染、出血等并发症、不良反应等指标。2.实验检测:(1)对入组MDS患者45例(正虚毒蕴组26例、毒盛正虚组19例)、健康对照者15例,取外周血,分离单个核细胞,以CD25~+CD86~+作为Breg标记,流式细胞仪检测CD25~+CD86~+细胞占外周血比例。(2)MDS患者45例(正虚毒蕴组26例、毒盛正虚组19例)及健康对照者15例,采用ELISA法检测外周血IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ水平。(3)对入组MDS患者45例,随机分为中西医结合治疗组30例,西药治疗对照组15例,治疗组又分为正虚毒蕴组17例、毒盛正虚组13例。经6月治疗后,ELISA法检测各组患者治疗前后外周血IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ水平。(4)MDS患者45例(正虚毒蕴组26例、毒盛正虚组19例)及健康对照者15例,取抗凝静脉血,提取DNA,运用序列特异性引物聚合酶链法检测KIR基因分型。结果:1.临床疗效:1)血象变化:(1)治疗组与对照组疗效比较:治疗组治疗后白细胞计数由2.67±2.09×10^9/L上升至3.73±3.65×10^9/L(P<0.05),血红蛋白浓度由61.59±22.70g/L上升至84.10±27.51g/L(P<0.05),血小板计数由74.83±96.22×10^9/L上升至112.70±136.68×10^9/L(P<0.05)。对照组治疗后血常规各项指标变化无明显统计学差异(P>0.05)。(2)不同证型疗效比较:治疗组正虚毒蕴型MDS治疗后白细胞计数由3.08±2.37×10^9/L上升至4.23±3.44×10^9/L(P<0.05);血小板计数由105.41±118.71×10^9/L,上升至141.76±163.76×10^9/L(P<0.05)。血红蛋白浓度由61.49±22.18g/L上升至83.28±28.25g/L(P<0.05),毒盛正虚组治疗后血红蛋白浓度由61.72±24.28g/上升至85.17±27.60g/L(P<0.05),不同证型MDS经中西医结合治疗前后血红蛋白差值比较未见明显差异(P>0.05)。2)西医疗效:治疗组总有效率86.67%,对照组总有效率73.33%;但两组治疗有效率无明显统计学差异(P>0.05)。治疗组正虚毒蕴型MDS治疗总有效率94.12%,毒盛正虚型MDS总有效率76.92%,经比较,治疗组不同分型MDS西医疗效也无统计学差异。3)中医疗效:(1)中医证候积分:治疗组治疗后中医证候积分由9.10±2.29分降低至2.93±2.59(P<0.01),对照组治疗后中医证候积分由8.40±2.80分降低至5.80±3.42分(P<0.05)。正虚毒蕴组MDS治疗后中医证候积分由8.71±2.49下降至2.06±1.66(P<0.05),毒盛正虚组MDS治疗后中医证候积分由9.62±1.98下降至4.08±3.15(P<0.05)。(2)中医证候疗效:治疗后治疗组中医证候疗效临床痊愈4例、显效11例、有效13例、无效2例,总反应率93.33%。西医对照组15例患者,临床痊愈0例、显效3例、有效6例、无效6例,总反应率62.50%,治疗组中医证候疗效明显优于西医对照组(P<0.05)。正虚毒蕴组临床痊愈3例、显效7例、有效7例、无效0例,总反应率100%,毒盛正虚组MDS临床痊愈1例、显效4例、有效6例、无效2例,总反应率84.62%,两组比较无明显统计学差异(P>0.05)。4)并发症观察:治疗组治疗期间感染发生率23.33%,明显低于对照组73.33%(P<0.05);治疗组治疗后出血等级改善率40.00%,明显高于对照组20.00%(P<0.05)。5)不良反应观察:治疗组消化道症状、皮肤黏膜反应等不良反应发生率均明显低于对照组(P<0.05),提示治疗组安全性优于对照组。2.实验结果:1)Breg、细胞因子、KIR在MDS患者及正常对照者比较(1)MDS组CD25~+CD86~+表型Breg比例0.1904(0.0400,2.5200)%,正常对照组0.0214(0.0000,0.1056)%,MDS组比例明显高于正常对照组(P<0.05);正虚毒蕴组0.1630(0.0199,2.8264)%,毒盛正虚组0.2869(0.1019,2.5399)%,两组CD25~+CD86~+表型Breg比例无明显差异(P>0.05)。(2)MDS组外周血细胞因子IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ分别为52.65(38.64,104.35)、210.60(153.70,429.97)pg/ml、235.73(148.04,497.21)pg/ml、99.30(71.06,255.54)pg/ml;正常对照组IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ分别为30.05(22.98,41.12)pg/ml、124.42(105.17,139.48)pg/ml、116.74(96.05,139.51)pg/ml、44.68(40.06,65.72)pg/ml;MDS患者IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ水平明显高于正常对照组(P<0.01);IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ水平随MDS危度增加而增加,正虚毒蕴组IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ水平分别为48.13(36.52,76.24)pg/ml、190.36(148.68,281.28)、190.21(116.48,296.10)pg/ml、85.68(61.18,115.04)pg/ml;毒盛正虚组对应分别为87.98(46.00,215.44)pg/ml、374.60(163.74,946.08)pg/ml、319.54(172.62,956.92)pg/ml、266.11(76.62,419.05)pg/ml,毒盛正虚组IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ显著高于正虚毒蕴组MDS患者<0.05)。(3)MDS患者KIR各基因频率与正常组比较:MDS患者较正常对照2DS3、2DS4显著较高(P<0.01);正虚毒蕴组、毒盛正虚组MDS患者各基因频率分别与正常组比较,正虚毒蕴型MDS中2DS3显著较高(P<0.01),毒盛正虚组MDS患者2DS4显著较高,2DS1显著较低,有统计学意义(P<0.01);正虚毒蕴组与毒盛正虚组MDS患者比较,其中正虚毒蕴组2DS1显著高于毒盛正虚组(P<0.01)。2)治疗组及对照组治疗后细胞因子变化及KIR疗效相关性分析(1)45例MDS患者分组治疗前后外周血细胞因子比较:治疗后治疗组IL-10由69.06(47.07,119.77)pg/ml下降至48.41(30.66,103.49)pg/ml(P<0.05),IL-4由238.77(166.20,531.26)pg/ml下降至180.25(133.86,318.50)pg/ml(P<0.05),IFN-γ由116.91(79.12,274.90)pg/ml下降至84.34(53.45,199.76)pg/ml(P<0.01);但治疗后MDS患者IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ仍显高于正常对照组(P<0.05)。治疗组治疗前后TGF-β1未见无明显变化(P>0.05);对照组治疗前后IL-10、TGF-β1、IL-4、IFN-γ均无明显变化(P>0.05)。(2)KIR疗效相关性分析:经6月治疗后,45例MDS患者中有37例为治疗应答组(疗效为HI以上),8例为治疗无应答组(疗效为PD),两组基因频率比较,应答组2DS1显著较高,差异显著(P<0.05,OR>1)。26例治疗组应答患者与4例治疗组无应答患者比较,2DS1显著较高,差异显著(P<0.05,OR>1)。结论:1)健脾补肾解毒方治疗MDS疗效良好,联合西医基础治疗可有效改善临床症状,控制感染、改善出血等并发症,明显优于单纯西医基础治疗,且可降低不良反应发生率,这在一定程度上验证了MDS“劳毒致病”的理论和应用价值。2)免疫抑制性Bregs参与了MDS发病的负调控机制,MDS患者CD25~+CD86~+表型Breg数量增高可触发异常克隆造血细胞的免疫逃逸。3)Bregs的负调控作用引起IL-10、TGF-β1、IL-4、IFNγ等细胞因子的释放增多,可致无效造血以及造血细胞过度凋亡。MDS毒盛正虚型患者外周血IL-10、IL-4、TGF-β1、INFγ显著高于正虚毒蕴型,在一定程度上反映了病情的危度及预后。4)KIR基因的多态性与MDS发病有关,KIR活化型基因2DS3、2DS4高表达,易导致对NK、T细胞传递激活信号异常,这可能是MDS造血干细胞无效造血的重要因素和“劳毒致病”的物质基础之一。5)健脾补肾解毒方治疗MDS作用机制之一可能为通过降低IL-10、IL-4、IFNγ等细胞因子释放,双向调节NK细胞数量及活化、抑制功能,发挥免疫调控作用,从而有利于恢复正常造血及清除造血干细胞的恶性克隆。