【摘 要】
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达氟沙星（Danofloxacin,DAN）抗菌谱广、杀菌作用强,常作为饲料添加剂来预防和治疗畜禽疾病,但不合理的使用造成了畜产品中药物的大量残留,严重危害人类的身体健康,因此,为了规范DAN的使用,保障动物源性食品安全和人类健康,本研究通过构建DAN噬菌体抗体库,从中筛选出针对DAN的特异性单链抗体（single-chain variable fragment,sc Fv）,为后期抗DAN重组抗
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达氟沙星（Danofloxacin,DAN）抗菌谱广、杀菌作用强,常作为饲料添加剂来预防和治疗畜禽疾病,但不合理的使用造成了畜产品中药物的大量残留,严重危害人类的身体健康,因此,为了规范DAN的使用,保障动物源性食品安全和人类健康,本研究通过构建DAN噬菌体抗体库,从中筛选出针对DAN的特异性单链抗体（single-chain variable fragment,sc Fv）,为后期抗DAN重组抗体的体外进化及DAN残留免疫学检测方法的建立奠定基础。本研究采用混合酸酐法将DAN与牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）和鸡卵清白蛋白（Ovalburmn,OVA）偶联,制备完全抗原DAN-BSA和DAN-OVA,经SDS-PAGE和紫外光谱扫描鉴定后,用DAN-BSA免疫BALB/c小鼠,4免后测定效价;取小鼠脾脏提取RNA,反转录成c DNA为模板,扩增抗体的重链可变区基因（Variable domain of heavy chain,VH）、轻链可变区基因（Variable domain of light chain,VL）并拼接成sc Fv,构建p CANTAB5E-sc Fv重组质粒并转化到E.coli TG1中,转化子经辅助噬菌体M13K07侵染后构建DAN噬菌体单链抗体库,交替使用DAN-BSA和DAN-OVA为靶抗原对噬菌体抗体库进行5轮亲和富集淘选,淘选结束,进行phage-ELISA检测,筛选到高亲和力、高特异性单链抗体sc Fv后,将其与原核表达载体p ET-22b连接,构建p ET22b-sc Fv重组质粒,转入E.coli DE3中进行蛋白诱导表达,并鉴定抗体蛋白的免疫学活性。结果显示,本研究成功制备出完全抗原DAN-BSA和DAN-OVA,用DAN-BSA免疫小鼠后血清抗体效价达1:25600;提取小鼠脾脏RNA,反转录成c DNA后,以此为模板成功扩增出抗体VH、VL基因,并拼接成sc Fv基因,大小分别约为350 bp、320 bp和750 bp。将sc Fv克隆至p CANTAB-5E载体后构建了DAN噬菌体单链抗体库,阳性插入率为91.6%,多样性为86.4%,库容为3.7×10~5 pfu/m L,滴度为8.1×1012 pfu/m L;用靶抗原DAN-BSA和DAN-OVA从抗体库中筛选到一株抗DAN的sc Fv-9,经大肠杆菌表达后鉴定,该抗体蛋白以包涵体形式存在,透析复性后,其半数抑制浓度IC50为149.10 ng/m L,最低检测限IC10为23.62 ng/m L,且与CIP、NOR、OFL和SAR均无交叉反应率。本研究从构建的DAN噬菌体抗体库中成功筛选出抗DAN的单链抗体,为后期抗体的体外进化及DAN免疫快速检测方法的建立奠定了基础。
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