铜作为动物必需的微量元素,在养殖业生产中,通过在动物饲料中添加高浓度铜以提高动物的生产性能。机体可以通过各种调节机制维持体内铜离子平衡,但当机体出现铜代谢紊乱或摄入铜过量均可导致铜中毒的发生。肝脏是铜蓄积的重要器官,铜中毒对肝脏的损害尤为严重。尽管铜毒理学研究表明铜会引起细胞发生氧化应激、损伤线粒体结构和功能,甚至诱导细胞自噬和凋亡,但还有更详细的机制有待于完善。线粒体作为一种重要的细胞器,参与能量代谢、调控钙离子稳态、诱导自噬和细胞凋亡等。研究指出,线粒体的功能和形态存在密切联系,线粒体的融合和分裂对维持线粒体正常的生理功能十分关键。线粒体融合和分裂的异常,将导致线粒体功能受损,甚至引起细胞凋亡或死亡。鉴于此,本文采用鸡的原代肝细胞为实验对象,采用无血清培养法培养,到细胞对数生长期分别用不同浓度的铜(10~200μM)处理细胞12或24 h后对鸡原代肝细胞的形态及活性、氧化应激水平、线粒体的结构和功能及线粒体动力学进行了分析。在此基础上,通过添加线粒体保护剂乙酰左旋肉毒碱,探究其对铜诱导的鸡原代肝细胞损伤的恢复效果和作用机制。结果表明:本实验通过对鸡原代肝细胞分离和培养方法的改良成功培养出细胞纯度约达到95%且细胞活力良好的鸡原代肝细胞。采用不同浓度的铜处理鸡原代肝细胞12或者24 h后发现,与空白组相比,低铜(10μM)对细胞活性和形态无影响,中铜(100μM)作用对细胞有一定的毒性作用,,高铜(200μM)处理12 h时就已经显著抑制了细胞的活性(P<0.05)造成细胞大量死亡,24 h时更是极显著抑制了细胞活性(P<0.01)。鸡原代肝细胞ROS含量随着铜浓度的升高而增加。与空白组相比,不同浓度铜处理在12和24 h时,100和200μM铜组细胞内ROS含量增长显著(P<0.05)。MDA含量结果与ROS结果几乎一致。在ATP含量的检测中发现,10μM铜对鸡原代肝细胞线粒体ATP的合成均无影响,但100、200μM的铜处理12 h和24 h时均极显著抑制ATP的合成(P<0.01)。在对线粒体膜电位检测时发现100、200μM的铜处理12和24 h,中髙铜组中鸡原代肝细胞膜电位显著降低(P<0.05)。线粒体动力学融合基因(OPA1、MFN1、MFN2)和分裂基因(DNM1、MTFP1、MTFR1)的表达均有所上升,但只有分裂基因在中高浓度铜组中的表达显著上升(P<0.05)。类似的结果也出现在蛋白表达中,不同组的OPA1并无显著影响,但与对照组相比,DNM1蛋白的表达在中高浓度铜组差异显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)。综上所述,中高浓度的铜会不同程度的引起鸡原代肝细胞的氧化应激,破坏线粒体结构和功能,破坏细胞的形态及影响细胞的活力,而线粒体动力学可能通过相对提高分裂基因和蛋白的表达参与铜诱导的鸡原代肝细胞损伤的过程。乙酰左旋肉毒碱确实能通过恢复线粒体功能、降低ROS水平来提高细胞的存活率,但其只对线粒体动力学分裂基因MTFR1有显著的抑制作用(P<0.05),其作用机制可能与线粒体动力学不存在显著的相关性。