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第一部分肺炎支原体感染相关致病机制研究背景：肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)是Eaton等首次于1944年从一位原发性非典型肺炎患者的痰标本中分离发现的。它是全球各年龄段呼吸道感染的常见病原体,可引起上呼吸道感染、气管炎、支气管炎、细支气管炎、社区获得性肺炎等,并可能与支气管哮喘的发生和急性发作相关。MP感染一般呈自限性过程,预后良好,但近年来越来越多报道发现重症与难治性MP肺炎呈上升趋势,部分患儿甚至出现严重致命并发症。MP主要通过粘附宿主细胞、胞内定殖、细胞毒作用及免疫反应等方式致病,但其确切的致病机制包括肺外表现的发生机制仍有待进一步研究阐明。我们实验室前期研究证明MP感染A549细胞后能诱导活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)形成,而ROS又进一步诱导了DNA损伤。那么MP在不同细胞系是否具有同样的DNA损伤效应?另外,MP的粘附作用被认为是MP致病机制中很重要的因素,粘附作用与ROS的产生是否存在关联?此外,前期研究还发现MP感染A549细胞后引起了细胞骨架蛋白波形蛋白的上调,波形蛋白与MP致病机制又有什么关系?鉴于现有的资料,本研究拟通过以下方面进行MP感3染相关致病机制研究：MP感染诱导不同细胞系造成DNA损伤的差异；MP诱导A549细胞产生ROS与粘附作用的关系；可能影响MP感染后A549细胞中波形蛋白表达改变的信号转导通路；以及波形蛋白表达对MP感染A549细胞生理应激过程的影响。方法：1.通过免疫荧光法检测yH2AX和碱性彗星实验检测DNA损伤。2.流式细胞术检测ROS水平。3.免疫荧光观察波形蛋白量的变化。4.蛋白质印迹法检测MAPK通路相关分子表达量的改变,荧光探针法检测胞内Ca2+水平。5.siRNA干扰波形蛋白表达后研究对MP感染A549细胞的生理功能的影响。结果：1.A549细胞经MP处理(10CFU/cell)4h后经免疫荧光检测yH2AX焦点无增加,而MP处理12h与24h后γH2AX焦点形成显著增加。HEK293细胞经MP处理4h后有一个非常快速的增加,而随之的12h与24h后yH2AX焦点并无增加。彗星实验提示A549细胞经MP处理6h和12h后均存在明显的拖尾现象。2.去粘附能力的MP与未处理的MP均能诱导A549细胞产生ROS,但两者诱导ROS产生的能力比较差异无统计学意义。3.免疫荧光观察到MP感染A549细胞后波形蛋白的荧光强度增强。4.MP感染A549细胞后胞内ERK1/2. p-ERK1/2、p38、p-p38、Ca2+水平均无变化。5.siRNA干扰波形蛋白后细胞的形态和生存率不受影响,但MP感染后诱导的yH2AX焦点形成减少。结论：1.MP可在A549细胞和HEK293细胞诱导产生DNA损伤,但产生的程度和时间不同,提示不同细胞系对MP感染所诱导的DNA损伤的效应存在差异。2.MP诱导A549细胞产生ROS与是否粘附无关。3.MP感染A549细胞后诱导波形蛋白上调,MAPK (ERK1/2及p38)及Ca2+/CaM-CaMK Ⅱ信号转导通路不参与MP诱导波形蛋白上调的过程。4.波形蛋白可能影响了MP诱导A549细胞产生DNA损伤的过程。第二部分不同呼吸道标本中肺炎支原体分子诊断的研究背景：MP常引起非特异性的呼吸道症状,且对p-内酰胺类抗生素治疗无效,所以正确及时的诊断就极为重要。MP的实验室诊断目前标准不一,尚缺乏敏感且特异的诊断方法。MP感染的诊断方法主要有培养、血清学方法以及PCR方法。其中血清学方法和PCR方法是临床上检测MP感染的主流手段。鼻咽吸出物(nasopharyngeal aspirate, NPA)和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage, BAL)均能作为PCR方法的标本。有关比较使用BAL和NPA作为PCR标本的灵敏度和特异度的文献很少。故本研究中我们拟评价不同的呼吸道标本(NPA和BAL)在荧光实时定量PCR诊断儿童MP感染中的价值,并求寻找到有助于诊断MP肺炎(MPP)的临床特征。方法：1.收集406例住院的肺炎患儿的NPA和BAL标本进行荧光实时定量PCR检测MP的DNA,并采集外周血检测MP特异性IgM。2.复习和整理所有患儿的病例记录,收集其中相关实验室数据,包括血常规、CRP、免疫球蛋白、T细胞亚群等。结果：1.共101例患儿诊断为MPP (24.9%). MPP.患儿年龄中位数为4.1岁,非MPP患儿年龄中位数为2.4岁,差异有统计学意义(p<0.001)。2.MPP与非MPP相比,相关实验室数据包括白细胞计数、中性粒细胞数目、免疫球蛋白(除了血清IgM)、T细胞亚群、BAL细胞学计数差异均无统计学意义。3.BAL-PCR阳性患儿BAL巨噬细胞比例低于BAL-PCR阴性患儿(p=0.003),而BAL中性粒细胞比例较高(p=0.007)。4.采用NPA与BAL作为PCR的标本的各项诊断指标相比差异均无统计学意义：NPA的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为78.6%,63.4%,39.8%和90.6%。BAL的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为70.3%,58.7%,36.0%和85.6%。结论：1.年龄是有助于诊断MPP的临床特征。2.BAL的PCR检测有助于判断局部炎症情况。3.由于NPA与BAL在PCR方法诊断MP上各项诊断指标均接近,而且收集NPA标本无创、经济,故NPA作为检测MP的标本要优于BAL。