苏云金杆菌芽胞中华亚种中一种具有杀线虫活性新毒素的初步鉴定及其与苏云金素的代谢关系

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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种在土壤中广泛分布的革兰氏阳性细菌。在其生长的过程中,会向胞外分泌一些小分子代谢物。如苏云金素(thuringienisn,简称Thu)和双效菌素(Zwittermicin A,简称ZwA)等。它们对许多农业害虫都具有毒杀活性,有着广阔的应用前景。苏云金芽胞杆菌中华亚种(B.thuringiensis subsp.chinensis)CT-43菌株是本室分离得到的一株高产苏云金素的野生菌株。本研究将CT-43在LB培养基中培养至指数期末期,采用有机溶剂萃取法提取上清液中的苏云金素。HPLC(Higher pressure liquidchromatogram)检测结果显示上清萃取液含两个主峰。经HPLC-MS(HPLC-Massspectrometry)进一步分析鉴定,保留时间为7 min的峰为苏云金素特征吸收峰,保留时间为6 min左右的峰为未知代谢物吸收峰,本研究将其命名为Tox-x。通过液质联用分析,得出其分子量是677。通过与目前己报道的苏云金杆菌所产代谢物进行比较,确定Tox-x为一新型代谢物。本研究进一步以秀丽小杆线虫为目标害虫对其进行活性检测,发现Tox-x对秀丽小杆线虫具有毒杀活性,原液稀释6.25倍的线虫致死率达到90%。本研究进一步通过确立培养基配方,补料成分及补料时间,分别得到产高纯度苏云金素的发酵工艺和产高纯度Tox-x的培养基。研究结果如下:将CT-43菌株在G培养基中培养至第20 h,同时补柠檬酸钠和葡萄糖至终浓度分别为2.0g L-1和16 gL-1,再继续发酵32 h,然后采用有机溶剂萃取法提取上清液中的苏云金素。HPLC检测结果显示,此发酵工艺制备的苏云金素峰面积占初提物总峰面积的74.84%,比用LB培养基发酵所得提取物中苏云金素占总峰面积的29.85%提高了一倍多。通过改变LB培养基中各营养物质的浓度,得到产高纯度的Tox-x的LB-1培养基。其配方是:酵母提取物浓度为18 g L-1,胰蛋白胨浓度为15 g L-1,氯化钠浓度为10 g L-1。将CT-43在LB-1培养基中发酵32 h,然后将发酵上清萃取液进行HPLC分析,结果显示LB-1培养基发酵所得提取物中Tox-x峰面积占初提物总峰面积66.59%,比用LB培养基发酵所得提取物中Tox-x占总峰面积的31.76%提高了两倍多。本研究同时将本室保存的6株CT-43质粒消除突变株进行了产苏云金素或Tox-x的HPLC检测,研究发现CT-43-7只能产生高纯度的苏云金素,不产Tox-x;而突变株CT-43-55只产Tox-x,而不产苏云金素。所以可以用相应的突变株来提纯苏云金素和Tox-x。
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