KLF4基因通过调节EMT对胃癌腹膜转移的影响

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目的:通过构建KLF4基因过表达胃癌细胞株和人胃癌裸鼠腹膜移植瘤模型,探讨KLF4基因上调后EMT主要标志物的表达变化以及对裸鼠腹膜移植瘤的影响。方法:1.将人胃癌BGC823细胞分为三组:转染过表达KLF4基因慢病毒载体的BGC823细胞为实验组,即BGC823-OE组;转染空病毒载体的BGC823细胞为阴性对照组,即BGC823-NC组;未作任何处理的BGC823细胞为空白对照组,即BGC823-Ctrl组。在慢病毒感染细胞72小时后通过荧光倒置显微镜分别观察三组细胞中绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况,经过嘌呤霉素筛选后,建立稳转株。2.通过qPCR检测各组BGC823细胞KLF4 mRNA的表达情况。3.通过Western Blot检测各组BGC823细胞KLF4蛋白的表达情况。4.选用4周龄BALB/c-nu雌性裸鼠18只,随机分为3组,每组6只,以接种感染KLF4过表达慢病毒载体的BGC823细胞的裸鼠为实验组即BGC823-OE组,接种感染空病毒载体的BGC823细胞的裸鼠为阴性对照组即BGC823-NC组,接种未作任何处理的BGC823细胞的裸鼠为空白对照组即BGC823-Ctrl组,经腹腔注射建立人胃癌裸鼠腹膜移植瘤模型(注射剂量为1×10~7个/ml),每天观察裸鼠生活和精神状态,每隔2天测量裸鼠腹围,并应用小动物活体成像探查裸鼠腹腔移植瘤转移情况。5.4周后将裸鼠脱颈处死,观察三组裸鼠脏器是否成瘤并计算成瘤率,对三组裸鼠肠系膜移植瘤的数量和重量进行统计,留取三组裸鼠成瘤脏器行HE染色。6.通过qPCR检测各组裸鼠移植瘤中KLF4、E-cadherin、N-cadherin的mRNA表达情况。7.通过Western Blot检测各组裸鼠移植瘤中KLF4、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表达情况。8.通过IHC检测各组裸鼠移植瘤中KLF4、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表达情况。结果:1.慢病毒感染BGC823细胞72h后,在荧光倒置显微镜下观察三组细胞,发现BGC823-OE组和BGC823-NC组有明显绿色荧光,而BGC823-Ctrl组未见有绿色荧光,用嘌呤霉素筛选并进行扩增后成功构建BGC823-OE组和BGC823-NC组的稳转细胞株。2.通过qPCR检测发现BGC823-OE组细胞KLF4 mRNA表达水平明显高于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05),而BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组之间KLF4 mRNA表达水平无显著性差异(P(29)0.05)。3.通过Western Blot检测发现BGC823-OE组细胞KLF4蛋白表达水平明显高于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05),而BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组之间KLF4蛋白表达水平无显著性差异(P(29)0.05)。4.通过对比裸鼠腹围增长值变化,发现BGC823-OE组裸鼠腹围增长值小于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05),而BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组之间腹围增长值无显著性差异(P(29)0.05)。通过小动物活体成像观察到BGC823-OE组和BGC823-NC组裸鼠在注射肿瘤细胞处有荧光,而BGC823-NC组裸鼠除了注射部位有荧光,其他部位也有荧光。5.BGC823-OE组裸鼠脏器成瘤率低于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05),BGC823-OE组裸鼠肠系膜移植瘤数量少于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05),BGC823-OE组裸鼠肠系膜移植瘤重量小于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05)。而BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组之间成瘤率、肠系膜移植瘤数量和重量无显著性差异(P(29)0.05)。6.通过qPCR检测发现BGC823-OE组裸鼠KLF4和E-cadherin的mRNA表达水平明显高于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05),BGC823-OE组裸鼠N-cadherin的mRNA表达水平明显低于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05)。BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组之间KLF4、E-cadherin、N-cadherin的mRNA表达水平无显著性差异(P(29)0.05)。7.通过Western Blot检测发现BGC823-OE组裸鼠KLF4和E-cadherin的蛋白相对表达量明显高于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05),BGC823-OE组裸鼠N-cadherin的蛋白相对表达量明显低于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05)。BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组之间KLF4、E-cadherin、N-cadherin的蛋白相对表达量无显著性差异(P(29)0.05)。8.通过IHC检测发现BGC823-OE组裸鼠KLF4和E-cadherin的蛋白相对表达量明显高于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05),BGC823-OE组裸鼠N-cadherin的蛋白相对表达量明显低于BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组(P<0.05)。BGC823-NC组和BGC823-Ctrl组之间KLF4、E-cadherin、N-cadherin的蛋白相对表达量无显著性差异(P(29)0.05)。结论:1.裸鼠体内BGC823各组移植瘤的转移受KLF4基因调控。2.上调KLF4基因后,EMT上皮标志物E-cadherin表达上调,间质标志物N-cadherin表达下调,KLF4过表达可能负调控EMT过程,抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长和转移。
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