人轮状病毒在1973年首次被发现,自此一直是全球引起婴幼儿腹泻主要的病原体之一。虽距离发现已几十年过去,但由于现阶段仍未有有效的治疗方法。因此,利用接种轮状病毒疫苗起到预防和降低感染比例。轮状病毒感染造成的社会和经济负担已经成为严重的全球公共卫生问题,这也引起了 WHO的高度关注,所以在开发疫苗方面调动了全球的资源为达到高度的配合。轮状病毒疫苗从上世纪八十年代起开始着手研究与制备,减毒活疫苗成为轮状病毒的主要趋势。群众在接种减毒轮状病毒疫苗后获得了一定的保护作用。但减毒活疫苗对于前期的生产制备要求较高,并且在接种后存在较多的安全隐患,包括毒力返祖、肠套叠的风险等。另外,母乳中抗体可能会使疫苗的有效性受到影响,特别是免疫缺陷的人使用活疫苗会带来更为复杂和严重的后果。因此,开发轮状病毒灭活疫苗对预防轮状病毒感染降低重症死亡率具有重要意义。值得注意的是,无论研制何种形式的疫苗,研究疾病的流行病学动态和病原体特征都是非常重要的。轮状病毒感染的前期流行病学研究表明,在不同地区和不同时间造成轮状病毒流行病毒株基因型是不同的。以糖蛋白VP7和结构蛋白VP4的抗原性为基础截至目前已发现27个G基因型和35个P基因型。最初流行主要毒株型为G1型,最近在中国多个地区的流行病学资料提示,G9型已经逐渐成为主要流行型。根据免疫交叉试验结果观察发现,G1和G9型病毒免疫产生的血清中和抗体对不同型的轮状病毒之间存在交叉识别,但不同型的交叉保护能力存在着明显的差异。其中,分析发现G1型轮状病毒免疫获得的血清对G9型病毒的中和能力较弱,同时G9型轮状病毒免疫出来的血清对G1型轮状病毒的保护效果也并不理想。[目的]在本实验中,我们采用实验室分离的两株人源性轮状病毒野毒株ZTR-68(G1P[8])株和ZTR-18(G9P[8])株,对双价(G1+G9)轮状病毒灭活疫苗进行研制,同时对其免疫原性和保护力进行研究观察。[方法]对实验室分离的轮状病毒ZTR-18(G9P[8])株进行传代培养,通过蚀斑法测定滴度,透射电镜观察形态后进行浓缩和层析纯化。将纯化液用甲醛灭活后制备G9型轮状病毒灭活疫苗,进行G1型轮状病毒灭活疫苗和G9型轮状病毒灭活疫苗的ED50研究。在确定G9型的有效免疫剂量后,与实验室事先制备好的G1型轮状病毒灭活疫苗进行配比免疫原性研究,确定二价轮状病毒灭活疫苗的有效免疫剂量。使用5日龄Balb/c小鼠,通过灌胃攻毒的方式,建立乳鼠腹泻模型。在确定模型成立后,制备双价(G1+G9)轮状病毒灭活疫苗(80EU+160EU),进行疫苗保护力研究。将双价(G1+G9)轮状病毒灭活疫苗(80EU+160EU)免疫Balb/c母鼠。通过腹腔免疫,免疫次数总计两次,时间间隔为两周。免疫结束后将母鼠与公鼠同笼,等待免疫母鼠产下乳鼠。选择5日龄的乳鼠进行攻击保护试验。分别于攻毒后的24h、48h、72h时挤压腹部,采集粪便。分别于24h,48h和72h,对乳鼠进行安乐死,取其肠道组织进行病理检测。同时随机解剖乳鼠,收集乳鼠血清,采集所需组织妥善保存为两份,一份后期制成石蜡切片方便进行HE染色,观察形态学变化。另一份组织用于提取RNA,测量病毒拷贝数。利用乳鼠血清进行ELISA实验,测量血清中抗体含量。[结果]分离培养的人源性轮状病毒ZTR-18(G9P[8])株经过传代后滴度能够达到106.0PFU/mL,制备条件成熟后,后期制备收获的轮状病毒灭活疫苗经检测具有良好的免疫原性。ED50试验结果表明,使用轮状病毒ZTR-68株制备的G1型轮状病毒灭活疫苗的ED50为20EU,因此选择80EU作为免疫评价剂量。使用轮状病毒ZTR-18株制备的G9型轮状病毒灭活疫苗的ED50为40EU,因此选择160EU作为免疫评价剂量。待免疫母鼠同笼生下乳鼠后,即可开展攻击保护试验。采集乳鼠血清,经ELISA检测,乳鼠体内抗体处于较高水平,中和抗体效价可达到1:1024。腹泻评分和百分率统计结果表明,与PBS对照组相比,疫苗免疫组乳鼠腹泻症状减轻甚至不腹泻,能够有效防止轮状病毒感染导致的腹泻。采集乳鼠组织(空肠、回肠、肾脏),后期制成石蜡切片进行HE染色以便观察,病理观察结果表明,与PBS对照组相比,免疫组乳鼠的小肠上皮细胞空泡化减少,肿胀及破损明显减轻。[结论]二价(G1+G9)轮状病毒灭活疫苗(80EU+160EU)具有良好的免疫原性,在乳鼠模型中能够有效防止或减轻轮状病毒感染导致的腹泻。