【摘 要】
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A类清道夫受体（Scavenger receptor，SR-A）是一种主要位于巨噬细胞膜表面的同源三聚体糖蛋白，能够介导多种配体进行内移。有关SR-A内移的调控机制目前尚所知甚少，一般认为其胞浆域部分不含引导内移的信号序列，只有几个潜在的磷酸化位点，但后者似乎不能完全介导受体的内移，为深入探讨A类清道夫受体胞浆域在介导受体内移中的作用，本研究以含有SR-A cDNA质粒为模板，采用PCR的方法扩增
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A类清道夫受体（Scavenger receptor，SR-A）是一种主要位于巨噬细胞膜表面的同源三聚体糖蛋白，能够介导多种配体进行内移。有关SR-A内移的调控机制目前尚所知甚少，一般认为其胞浆域部分不含引导内移的信号序列，只有几个潜在的磷酸化位点，但后者似乎不能完全介导受体的内移，为深入探讨A类清道夫受体胞浆域在介导受体内移中的作用，本研究以含有SR-A cDNA质粒为模板，采用PCR的方法扩增不含胞浆域序列的清道夫受体（以下简称截短型受体），同时扩增全长清道夫受体作为对照，PCR产物经纯化酶切后，进一步亚克隆到PcDNA3.1／HisB中，测序结果表明清道夫受体基因已经重组到载体中，开放性阅读框架正确，编码的氨基酸序列无误。将重组产物经脂质体Lipofectamine（LF2000）介导转化入CHO细胞中，在含G418选择性培养液中培养筛选14天后，分离阳性克隆，继续培养。采用流式细胞计数仪（FACS）鉴定转化筛选后细胞能否表达具有功能的清道夫受体，结果发现转化的CHO细胞可以稳定表达SR-A的蛋白，但受体胞浆域去除后摄取配体的能力明显弱于全长组（1：1.337）。为进一步比较两组细胞受体内移的改变，用荧光DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL）37℃孵育转化细胞5小时后，激光共聚焦显微镜下观察到：全长组荧光散在分布于细胞膜和细胞器，而截短组荧光只局限于细胞膜。用荧光分光光度计定量分析受体介导配体内移率的改变，结 南京医科大学博士学位论文果发现在与配体孵育10min、20min和40min后，全长组SR一A对DII一acLDL的摄取率分别为26%、43 .3%和78.1%，而去除胞浆域后DII一acLDL的摄取率则分别降至1 4.9%、17.05和14.7%，以上说明受体胞装域去除后受体的内移功能明显受到抑制，从而证明SR一A胞浆域起着介导受体内移的作用。此外用蛋白激酶抑制剂staurosporine （STA）和H:处理细胞，利用荧光分光光度计比较细胞内磷酸化水平的变化对受体结合和摄取配体的影响，结果发现:STA和H7可以增加全长组受体与配体的结合及摄取，而截短型受体不受STA和H7的调控，说明磷酸化药物可能是通过SR-A胞浆域发挥作用。在此基础上进一步比较胞浆域去除后对受体介导的细胞内脂质积聚和泡沫化的影响，用高浓度的Ac一LDL处理细胞，结果发现去除胞浆区的SR-A只分布于细胞膜表面，不能介导配体一受体复合物进入胞装内，受体介导的配体内移率明显减少，细胞内脂质含量下降，泡沫化细胞难以形成。不仅如此，如将截短的SR一A转入能正常表达SR-A的THP一1细胞，发现转染细胞的脂质含量明显减少。该结果首次证明去除SR-A的胞浆区后，可阻止泡沫细胞的形成。提示SR一A胞浆区可能是巨噬细胞泡沫化的干预靶标。
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