脂质磁转染技术应用于动物细胞多基因共转的初步研究

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纳米材料作为基因和药物分子的运输工具首先在生物医学领域中得到应用,从此引起了广泛的关注,为人体疾病的药物和基因治疗、诊断以及分子水平检测提供了良好的载体介质。其本身具有的纳米效应如小尺寸,大比表面积,可控释性,易修饰性,不仅使得纳米载体材料拥有较大的负载功能分子容量,还能被人工赋予特定的组织器官或亚细胞靶向性。其中磁性纳米材料又由于本身的顺磁性,良好的生物相容性(在医学影像学中广泛应用于造影剂)以及良好的传输效率而被广泛的研究和应用。脂质体是一种传统而成熟的基因或者药物传输载体,具有高效,操作简单的优点,但是其高毒性以及在基因表达上瞬时性的缺陷成为应用的主要制约瓶颈。本研究将脂质体转染试剂与磁性纳米基因载体相结合,弥补各自的缺陷,并系统研究了此纳米基因载体复合物作为真核细胞转基因载体的可行性与优越性。脂质体与磁性纳米基因载体复合物运输外源基因转染的过程被称为脂质磁转染,本文系统的从下述方面对脂质磁转染系统进行了探索,为其应用于真核细胞的多基因共转奠定了研究与实践基础,主要得出以下结论:(1)对脂质磁性纳米基因载体复合物在微观形态,疏水粒径及ζ电位常数,负载DNA分子能力等方面进行了表征。通过原子力显微镜观测,脂质磁性纳米基因载体复合物呈现出纳米级聚集状态,在结合外源DNA分子后形成了致密的渔网状结构,大大增强了其负载DNA分子的能力;通过激光粒度电位分析,测得为纳米粒子的疏水粒径,combiMAG的平均粒径为161.7nm,复合物combiMAG/DNA、combiMAG/lipo/DNA的平均粒径依次增加,分别为170.5nm、189.9nm,这可以说明基因载体复合物已经由分子自组装过程初步形成。combiMAG的ζ电位为13.8mV,脂质体liposome、liposome/DNA、combiMAG/lipo/DNA/的ζ电位依次为49.4mV、24.3mV、33.9mV,负载基因的纳米基因载体复合物带较强的正电性,有利于基因载体复合物通过静电作用吸附到细胞膜表面并通过细胞吞噬作用被转运至细胞内。(2)对脂质磁转染实验条件进行了优化与验证,并实现了两个基因共转。对脂质磁转染的一个重要因素:磁场作用时间进行了试验研究,表明在磁场作用4h条件下转染效率最高。细胞共转实验表明,同时表达GFP和RFP的双阳性细胞为29.6%,即脂质磁转染介导双基因共转率为29.6%,总体阳性率达到41.48%,在阳性细胞中的共转双阳性比例达到71.4%。(3)通过间接定位荧光示踪,对荧光磁转染后特定的细胞区域来展现脂质磁转染过程中纳米基因载体的细胞摄入过程,直观地观察到大部分磁性纳米颗粒跨膜后进入细胞以及12h被细胞核摄入,为进一步研究揭示细胞摄入的过程机制奠定基础。整体研究结果表明,脂质磁转染技术在基因传输尤其是细胞转染方面体现出多种优越特性。更重要的是,可操作性强,费时短,良好的生物相容性,较大的基因转载量,简单易行的实验过程,具有较高的共转染成功率,在核酸分子的递送方面可实现多个功能基因共转,具有很好的研究和应用前景。
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