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背景脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)为临床上脊柱外科中常见的疾病,其病因为剧烈创伤引起的感觉和运动功能受损。脊髓损伤可导致脊髓功能失调,进而对脊髓的正常生理功能造成损害,其中包括感觉、运动、自主以及反射。随着经济的迅速发展以及人民生活水平的提高,交通业、建筑业等已较过去有了飞速发展,然而随之而来的脊髓损伤患者日渐增多。因脊髓损伤具有高致残率,因此给患者造成了极大的痛苦,同时也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。药物治疗以及外科手术是传统的治疗脊髓损伤的方法,这些方法尽管能够在一定程度上缓解患者的痛苦,但疗效依然有限,无法从根本上解决问题。神经修复是脊髓损伤治疗过程中面临的关键问题,而细胞移植为脊髓损伤治疗提供了新的方法。间充质干细胞为多能成体干细胞,其能够向中胚层细胞分化,部分还能分化为非中胚层谱系,因此是组织修复以及再生的营养因子。骨髓来源的间充质干细胞(bonemesenchymal stem cells,BMSCs)具有极高的自我更新活性和分化潜能,在不同条件先能够被诱导成为多种细胞,其中即包括神经细胞。目前,国内外诱导BMSCs向神经细胞分化的诱导剂主要为维甲酸、二甲基亚砜、β-巯基乙醇、甘油等,但采用上述诱导剂诱导后的神经元样细胞在体外存活时间较短,其中部分诱导剂还具有一定的毒性,无法在临床实际治疗中应用。归根结底,体外诱导BMSCs向神经细胞分化的最终目的是应用与临床实际治疗,所以寻找新的有效且无害的诱导剂是目前最值得关注的问题之一。中药具有来源广泛、副作用相对较低等优势,已被证实对细胞的生长以及分化具有促进作用,且无毒性,因此有利于分化后细胞活体移植。大量研究显示,多种中药在诱导干细胞分化方面具有突出表现。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)为一种生物碱,是从中药川芎中提取的有效成分之一,具有抗氧化、阻止细胞中钙离子负荷超载、抗神经元凋亡、保护神经细胞功能等作用,因此被广泛用于神经内科的各种缺血性和创伤性疾病的治疗。研究发现,川芎嗪联合BMSCs移植能够修复脊髓损伤,并诱导后者向骨髓基质细胞分化,但其中的具体作用机制尚不十分清楚,且目前也尚未有研究对BMSCs联合川芎嗉治疗以及单独使用BMSCs治疗在神经功能恢复方面的效果进行比较。目的本研究以大鼠脊髓损伤模型作为研究对象,比较采用BMSCs移植、川芎嗪联合BMSC移植治疗脊髓损伤后神经功能的恢复情况,并对其中的相关机制进行探讨,旨在为川芎嗪联合BMSC移植应用于脊髓损伤治疗提供理论和实验依据。方法(1)采集出生3天的SD大鼠股骨和胫骨,收集骨髓腔中的细胞并分离培养,用流式细胞术检测BMSCs表面标记物CD34、CD44、CD45、CD90、CDllb和CD106,用以鉴定分离培养的BMSCs。建立Wistar大鼠脊髓损伤模型。将Wistar大鼠分为对照组、模型组、BMSCs组、BMSCs+TMP组,各组大鼠经过相应处理,分别采用斜板实验、改良Tarlov分级和Basso Be-attie Bresnahan(BBB)评分对各组大鼠的运动功能进行评估;检测各组大鼠神经电生理学感觉诱发电位(sensory evoked potential,SEP)和运动诱发电位(Motion evoked potential,MEP)。采集各组大鼠的脊髓组织并制作石蜡切片,采用免疫组化法检测各组大鼠脊髓组织中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)表达。(2)采集大鼠脊髓组织,分离培养脊髓神经元细胞。采用H2O2作用于大鼠脊髓神经元细胞,建立受损脊髓神经元细胞模型。将大鼠脊髓神经元细胞随机分为对照组、模型组、BMSCs组、BMSCs+TMP组,各组细胞按照分组要求进行相应处理,继续培养48 h后检测细胞凋亡情况、增殖活性;收集各组细胞培养上清,检测上清中TNF-α的表达;检测各组细胞中caspase-3、GFAP、NGF蛋白的表达。结果(1)BMSCs形态学观察和鉴定结果显示,当培养24 h后,部分细胞开始粘附在培养瓶底部,其中的大多数成对出现,外形呈椭圆形并具有明显的透光性;继续培养72 h后,可观察到视野下有球形和梭形的细胞;在培养的第5天时,可观察到出现梭形和多边形细胞。在显微镜下,培养瓶内BMSCs的数量显著增加。第1代至第3代的细胞生长状态较好且具有较强的增殖活性,细胞主要为单层细胞。培养第1天和第2天时,细胞外形扁平,呈纺锤状和不规则状,细胞核清晰可见。第3代细胞形状较为均匀。采用流式细胞仪检测大鼠BMSCs表面标志物,结果显示3代BMSCs细胞阳性表达CD44、CD90和CD106,而CD11b、CD34和CD45表达呈阴性。上述结果证实已成功分离培养BMSCs。各组大鼠运动功能恢复情况检测结果显示,与术后1周相比,模型组、BMSCs组和BMSCs+TMP组大鼠在2周末时的斜板临界角度数、BBB评分和Tarlov评分均显著升高(P<0.05)。与对照组相比,其他组的斜板临界角度数、BBB评分和Tarlov评分均显著下降(P<0.05)。与模型组相比,BMSCs组和BMSCs+TMP组的斜板临界角,BBB评分和Tarlov评分显著增加,斜板临界角度数、BBB评分和Tarlov评分均明显增高(P<0.05);与BMSCs组相比,BMSCs+TMP组的斜板临界角,BBB评分和Tarlov评分显著增加,斜板临界角度数、BBB评分和Tarlov评分均明显增高(P<0.05)。各组大鼠术后SEP检测结果显示,在手术后2周,检测各组大鼠的SEP,用以观察大鼠神经生理反应的恢复情况。与对照组相比,其他各组大鼠的SEP潜伏期明显增加,振幅明显下降(P<0.05)。与模型组相比,BMSCs组和BMSCs+TMP组大鼠的SEP潜伏期显著降低,且振幅显著增加(P<0.05)。与BMSCs组相比,BMSCs+TMP组大鼠的SEP潜伏期明显降低,振幅明显增高(P<0.05)。各组大鼠术后MEP检测结果显示,在手术后2周,对各组大鼠进行MEP实验,观察并记录MEP的潜伏期和振幅的变化。与对照组相比,其他各组大鼠的MEP潜伏期显著增加,而幅度则明显下降(P<0.05)。与模型组相比,BMSCs组和BMSCs+TMP组大鼠的MEP潜伏期明显减少,幅度显著增加(P<0.05)。与BMSCs组相比,BMSCs+TMP组大鼠的MEP潜伏期明显降低,幅度明显增高(P<0.05)。免疫组化检测结果表明,与对照组相比,其他各组大鼠脊髓组织中GFAP和NGF蛋白的阳性表达率均显著降低(P<0.05);与模型组比较,BMSCs组和BMSCs+TMP组大鼠脊髓组织中GFAP和NGF蛋白的阳性表达率均显著升高(P<0.05);BMSCs+TMP组大鼠脊髓组织中GFAP和NGF蛋白的阳性表达率显著高于BMSCs组(P<0.05)。上述结果表明,川芎嗪注射液与BMSCs联合应用对脊髓损伤的恢复有显著影响。(2)细胞凋亡检测结果显示,与对照组相比,其余各组细胞的凋亡率均显著升高(P<0.05);与模型组相比,BMSCs组和BMSCs+TMP组细胞的凋亡率均明显降低(P<0.05);与BMSCs组相比,BMSCs+TMP组细胞的凋亡率明显降低(P<0.05)。上述研究结果表明,川芎嗪联合BMSCs移植能够更有效的保护H202损伤的脊髓神经元,抑制其凋亡。Caspase-3蛋白表达检测结果显示,与对照组相比,其余各组细胞中caspase-3蛋白的表达均明显上调(P<0.05);与模型组相比,BMSCs组和BMSCs+TMP组细胞中caspase-3蛋白的表达均明显降低(P<0.05);与BMSCs组相比,BMSCs+TMP组细胞中caspase-3蛋白的表达明显降低(P<0.05)。上述研究结果表明,川芎嗪联合BMSCs移植能够抑制凋亡相关蛋白caspase-3的表达,从而起到抗H2O2损伤引起的脊髓神经元凋亡的作用。细胞活性检测结果表明,与对照组相比,其余各组细胞的活性均显著降低(P<0.05);与模型组相比,BMSCs组和BMSCs+TMP组细胞的活性均明显升高(P<0.05);与BMSCs组相比,BMSCs+TMP组细胞的活性明显上升(P<0.05)。上述研究结果表明,芎嗪联合BMSCs移植能够有效提高H202损伤脊髓神经元的活性,促进其增殖。细胞培养上清中TNF-α水平检测结果显示,与对照组相比,其余各组细胞培养上清中TNF-α水平均显著上述(P<0.05);与模型组相比,BMSCs组和BMSCs+TMP组细胞培养上清中TNF-α水平均明显降低(P<0.05);与BMSCs组相比,BMSCs+TMP组细胞培养上清中TNF-α水平明显降低(P<0.05)。脊髓损伤后,神经细胞可产生大量的TNF-α致脊髓组织溃变坏死,本研究结果表明,川芎嗪联合BMSCs移植能够抑制H202损伤脊髓神经元释放TNF-α,从而发挥保护神经细胞的作用。各组细胞中GFAP和NGF但表达检测结果显示,与对照组相比,其余各组细胞培中GFAP和NGF蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05);与模型组相比,BMSCs组和BMSCs+TMP组细胞中GFAP和NGF蛋白的表达水平均明显增高(P<0.05);与BMSCs组相比,BMSCs+TMP组细胞中GFAP和NGF蛋白的表达水平明显上升(P<0.05)。上述研究结果表明,川芎嗪联合BMSCs移植能够诱导GFAP和NGF的表达,进而促使H2O2损伤的脊髓神经元活化和生长,最终发挥保护神经元、促进神经元功能恢复的作用。结论(1)川芎嗪联合BMSCs移植可显著改善脊髓损伤大鼠的神经功能。(2)川芎嗪联合BMSCs移植可有效抑制由H202引起的脊髓神经元损伤,维持其活性,抑制凋亡,其机制可能与抑制凋亡相关蛋白caspase-3表达,上调促神经活化蛋白GFAP和促神经生长相关蛋白NGF的表达有关。