背景和目的自体骨、同种异体骨、异种骨等各类来源的移植物常被用于修复骨折、骨缺损等临床常见疾病,但目前由于二次手术痛苦、传播感染风险、宿主整合困难等问题,使此类修复方式存在一定的局限性。而采用组织工程技术可构建骨组织,且结构及生理功能与人体骨类似,能弥补甚至解决骨折、骨缺损治疗产生的临床局限;其中细胞和生长因子作为复合物构建的核心要素,在修复或再造组织、器官的过程中起到了决定性作用。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源广泛,因具有强大的增殖作用与多向分化功能而成为各类研究中的种子细胞。目前组织工程技术通过运用各类MSCs在临床试验当中取得了一定成果,尤其在对口腔颌面部外伤、肿瘤等引起的颌骨骨折、缺损研究中发现,MSCs能增加新骨形成,并减少自体骨愈合的时间。但大量研究显示,仅使用MSCs发挥的生物学作用过于单一,往往需要整合各类高效的生长因子从而更好地促进成骨。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族中最重要的生长因子之一,目前有超过20名BMPs成员在人体中被发现。研究表明骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有强大的成骨能力,且成骨效应优于曾被批准用于临床治疗的BMP2与BMP7,但当前对其成骨机制的了解还不够深入。同时在临床研究中,复合何种载体材料以及如何精确控制药物递送系统来辅助BMP9全面、有效地形成骨组织是现阶段亟待解决的问题。骨组织的形成往往伴随着复杂的生物学机制,其中离不开神经、血管等共同发挥作用,研究证实骨组织当中的各类神经纤维可支配骨髓、骨膜,并能通过长入骨痂在骨愈合的过程中扮演着重要角色。而神经生长因子(nerve growth factor,NGF)作为首个被发现的神经营养因子,除了对中枢神经与外周神经元各项生理机能进行调节外,也能够诱导神经纤维长入未成熟的骨组织及骨痂。近年来各项研究表明,NGF具有促进成骨的能力,并能够改善骨组织形成中的血管微环境,特别是在对下颌骨缺损修复、种植体周围骨愈合、牙体矿化发育等口腔颌面部研究中常被作为复合支架的关键生长因子。但NGF究竟是通过在骨组织中支配神经纤维还是刺激细胞或多肽类物质来主要进行成骨的机理还不甚清楚,因此,如何在组织工程技术中有效地利用NGF配合成骨值得深入研究。综上所述,本研究通过对比单独和联合应用BMP9与NGF刺激C3H10T1/2骨向分化,观察此过程中经典成骨标志物的表达模式,并初步探讨BMP9与NGF在MSCs骨向分化中的作用,为口腔颌面部再生研究及组织工程领域中的多细胞因子联合应用提供实验基础。方法1.细胞培养C3H10T1/2细胞接种于250ml培养瓶,用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的H-DMEM培养基常规培养;293T细胞接种于100mm培养皿,用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM:F12培养基常规培养。细胞均置于37℃、5%CO2条件下孵育,待生长密度达80%时,用0.25%胰酶消化传代,选取状态良好的细胞代数用以实验。2.不同浓度NGF对C3H10T1/2骨向分化能力的测定待C3H10T1/2生长密度达70%-80%时,诱导其骨向分化,同时分别加入终浓度为10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml的3种NGF进行刺激作为实验组,对照组不用NGF处理。分别于处理后3d检测骨向分化早期相关基因的mRNA转录水平及蛋白表达,7d检测ALP染色情况,21d检测骨向分化晚期特征钙结节的形成。3.外源性BMP9对C3H10T1/2内BMP9的表达调控首先利用重组腺病毒Ad-BMP9与Ad-GFP分别感染293T进行扩增,反复扩增后用以转染C3H10T1/2,并用荧光显微镜观察、甄选滴度较高的病毒进行实验。待C3H10T1/2生长密度达50%时,按腺病毒转染标准程序对实验组转染适量Ad-BMP9,对照组转染适量Ad-GFP,并密切关注24h内C3H10T1/2内荧光表达情况。转染后12h对两组C3H10T1/2进行收集,并检测BMP9的mRNA表达情况。4.BMP9与NGF对C3H10T1/2骨向分化不同时期成骨标志物的影响4.1骨向分化早期标志物检测:待C3H10T1/2生长密度达70%-80%时,诱导其骨向分化,同时按不同处理因素将实验分为(1)GFP组:使用绿色荧光进行空白对照;(2)NGF组:单独使用NGF刺激细胞;(3)BMP9组:单独使用Ad-BMP9刺激细胞;(4)NGF+BMP9组:联合使用NGF与Ad-BMP9刺激细胞。分别于处理后3h,12h,24h,48h检测骨向分化早期相关基因的mRNA转录水平及蛋白表达,3d,7d检测ALP活性及染色情况。4.2骨向分化晚期标志物检测:对GFP组、NGF组、BMP9组、NGF+BMP9组按上述不同因素处理,持续刺激C3H10T1/2骨向分化。分别于处理后9d,12d检测骨向分化晚期相关基因的mRNA转录水平及蛋白表达,14d,21d检测钙结节形成的染色程度。结果1.RT-PCR结果显示:骨向分化3d后,采用10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml NGF刺激的实验组中Runx2 mRNA的相对表达量均显著高于无NGF刺激的对照组(P<0.001),且NGF浓度为10ng/ml时,Runx2表达量最高(P<0.01或P<0.001)。Western blot结果进一步显示:骨向分化3d后,各实验组与对照组均检测到Runx2的蛋白表达,且NGF浓度为10ng/ml时,Runx2的蛋白表达最为明显。ALP染色结果显示:骨向分化7d后,各实验组与对照组的部分细胞中均呈现出蓝色深染物,且NGF浓度为10ng/ml时,染色程度最为密集。茜素红染色结果显示:骨向分化21d后,各实验组与对照组的部分细胞中均可见红色钙结节形成,且NGF浓度为10ng/ml时,钙结节形成数量最多。2.扩增后的重组腺病毒具备良好活性,Ad-BMP9与Ad-GFP转染C3H10T1/2后可在细胞内成功表达,并测得最适感染量为4μl/ml,感染效率约为30%。C3H10T1/2经Ad-BMP9转染12h后,已能通过荧光显微镜观察到部分细胞表达绿色荧光。RT-PCR的结果进一步显示:感染12h后,经Ad-BMP9转染的实验组细胞内BMP9 mRNA相对表达量显著增高,为对照组细胞内BMP9 mRNA的5.14倍(P<0.001)。3.RT-PCR结果显示:骨向分化3h后,NGF组,BMP9组,NGF+BMP9组中Runx2与Col I的mRNA相对表达量均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01或P<0.001),并在NGF+BMP9组中表达最高(P<0.001);骨向分化12h后,各实验组中Runx2与Col I的mRNA相对表达量依然明显高于对照组(P<0.05或P<0.001),同样在NGF+BMP9组中表达最高(P<0.001)。Western blot和Quantity One灰度值扫描结果显示:骨向分化24h后,各实验组中Runx2的蛋白表达均明显高于对照组(P<0.05或P<0.001),并在NGF+BMP9组中表达最强(P<0.001);骨向分化48h后,各实验组中Runx2的蛋白表达依然明显高于对照组(P<0.001),同样在NGF+BMP9组中表达最强(P<0.001)。ALP活性结果显示:骨向分化3d后,各实验组中ALP活性强度均显著高于对照组(P<0.001),并在NGF+BMP9组中表达最强(P<0.001);骨向分化7d后,各实验组中ALP活性强度依然显著高于对照组(P<0.001),同样在NGF+BMP9组中表达最强(P<0.001)。ALP染色结果显示:各实验组与对照组在骨向分化3d与7d后,部分细胞中均呈现出蓝色或蓝黑色深染物,以NGF+BMP9组最为密集,且随时间推移每组深染物的颜色与范围分别呈明显加深与扩大趋势。4.RT-PCR结果显示:骨向分化9d后,各实验组中OPN的mRNA相对表达量均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01或P<0.001),并在NGF+BMP9组中表达最高(P<0.001)。Western blot和Quantity One灰度值扫描结果显示:骨向分化12d后,各实验组中OPN的蛋白表达均明显高于对照组(P<0.05或P<0.001),并在NGF+BMP9组中表达最强(P<0.001)。茜素红染色结果显示:骨向分化14d与21d后,各实验组与对照组的部分细胞中均可见红色钙结节形成,以NGF+BMP9组最为明显,且随时间推移每组钙结节的数量呈明显增多趋势。结论1.NGF在早期与晚期分别促进了相应成骨标志物的表达,说明其能增强C3H10T1/2骨向分化的能力。当NGF浓度为10ng/ml时,对C3H10T1/2骨向分化的增强作用最为明显,推测NGF在对C3H10T1/2骨向分化的增强过程中存在阈值,过量NGF可能会对骨向分化造成抑制。2.BMP9与NGF在C3H10T1/2骨向分化早期增强了经典成骨标志物的表达,说明二者具有协同促进作用。特别是Runx2与Col I的mRNA早在分组处理后3h能被检测到明显的表达上调,说明BMP9与NGF促进成骨的相关信号通路可能在刺激伊始即被激活。3.BMP9与NGF增强了C3H10T1/2晚期成骨标志物的表达,联合应用能促进大量钙化结节的形成,进一步说明了二者对间充质干细胞的骨向分化具有协同促进作用。