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正常的心脏发育过程受到多种基因的精确调控,发育过程中任一基因的改变都可能导致先天性心脏病的发生。本实验室前期筛选出一个新的人类心脏发育候选基因Nulp1,利用果蝇模型初步证明该基因的同源基因CG7927与心脏发育有关。本文进一步鉴定该基因的相互作用蛋白,探讨其在心脏发育过程中的信号通路。果蝇CG7927基因(登录号为NM 139917.2)位于果蝇3号染色体上,mRNA长度为2500 bp,含7个外显子,6个内含子。该基因包含一个bHLH和一个功能未知命名为DUF654的结构域,这2个结构域高度进化保守。本实验室前期的研究提示,人类Nulp1、Fhl2和fi-catenin基因可能有相互作用。本文将果蝇Nulp1、Fhl2和β-catenin基因首先克隆到pMD18-T载体中,经酶切证实后,送到公司测序,证明克隆的质粒正确,再分别构建成pCMV-myc-Nulp1, pCMV-tag2B-Fhl2和pCMV-tag2B-Arm质粒。将pCMV-myc-Nulp1和pCMV-tag2B-Fhl2转入HEK293细胞系,经提取蛋白和转膜后,分别用flag和myc单克隆抗体进行westernblot检测,检测两者之间是否有相互作用。研究结果表明,Nulp1和Fhl2蛋白全长存在相互作用。为了进一步分析该两种蛋白的具体结合位点,将Nulp1基因按结构域的组成分成6个区段,分别克隆构建成pCMV-myc-Nulp1-P1, pCMV-myc-Nulp1-P2, pCMV-myc-Nulp1-P3等3个亚质粒,将Fhl2基因全长分别构建成pCMV-tag2B-Fhl2-PET和pCMV-tag2B-Fhl2-6LIM亚质粒。将这些质粒分别成组转入HEK293细胞系中进行westernblot分析,结果表明pCMV-myc-Nulp1-P1, pCMV-myc-Nulp1-P2和pCMV-myc-Nulp1-P3与pCMV-tag2B-Fhl2有相互作用。同时将pCMV-myc-Nulp1和pCMV-tag2B-Arm转入HEK293细胞系中,经westernblot分析表明,Nulp1和Arm全长可能不存在相互作用。为了证实Nulp1、Fhl2和Arm在细胞内的分布情况,分别将这两个基因构建成表达绿色荧光的质粒pEGFP-C1-Nulp1,和pEGFP-N1-Arm,表达红色荧光的质粒pdsRED2-N1-Fhl2和pdsRED2-N1-Arm。进一步将这些质粒成组转入COS7细胞系中研究这些基因在细胞内的蛋白分布及相互作用情况。结果表明,Nulp1蛋白在细胞内位于细胞质,Fhl2蛋白位于细胞核和细胞质中,Arm蛋白位于细胞质和细胞核中。Nulp1蛋白与Fhl2蛋白在细胞质有共定位,Nulp1蛋白与Arm蛋白在细胞质有共定位,Fhl2与Arm蛋白在细胞质和细胞核都有共定位。上述结果表明,Nulp1和Fhl2在细胞内有直接相互作用,Nulp1和Arm蛋白可能有间接的相互作用,三者之间是否组成三元复合体有待深入研究。另外本文还制备了Nulp1和Lefty2多克隆抗体,westernblot分析表明,Nulp1多克隆抗体的效价为1：2000。取果蝇每1.5小时发育阶段的胚胎蛋白进行westernblot结果表明Nulp1蛋白在果蝇胚胎发育的0-16小时阶段均有表达,但胚胎发育17小时无表达。在果蝇幼虫和成虫阶段Nulp1均有表达。Lefty2多克隆抗体效价为1：3000,但斑马鱼胚胎的western结果表明该抗体的特异性差不适合进一步的应用。