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我国是世界上最缺水的国家之一,干旱是我国农业生产主要自然灾害,且盐碱地和次生盐碱化耕地的面积逐年增加,这些不利的环境条件严重制约了我国的农作物产量。为了适应这些不利的环境,植物内部发展一系列的防卫措施,也需要非生物胁迫应答基因参与。目前已经鉴定了许多盐和干旱应答基因并验证了他们在非生物胁迫中的功能,但关于很多非生物胁迫相关的基因的生物学功能仍然是未知的。本研究详细地阐述3个大豆基因,泛素结合酶基因GmUBC2、SnRK2类蛋白激酶基因GmPK和Na+/H+逆向转运蛋白基因GmNHX2,在非生物胁迫中的生物学功能,旨在为通过遗传工程的方法改善大豆耐盐和抗旱性提供基因资源和理论依据。1、本研究克隆一个与酵母RAD6的同源的大豆泛素结合酶基因GmUBC2。GmUBC2在大豆根、茎和叶中都表达并受高盐和干旱胁迫诱导表达。用GmUBC2-EGFP融合蛋白将GmUBC2定位于转基因拟南芥植株细胞的细胞质和细胞核中。不仅过表达GmUBC2转基因植株中非生物胁迫应答基因(离子转运蛋白基因AtNHX1和AtCLCa,脯氨酸合成的关键酶基因AtP5CS1,SOD的铜分子伴侣基因AtCCS基因)的表达水平明显增加,而且过表达GmUBC2转基因植株的脯氨酸、Na+含量和SOD活性均增加,过表达GmUBC2基因的拟南芥转基因植株的耐盐和抗旱性明显高于野生型植株,表明GmUBC2可能是植物耐盐抗旱的正调节因子,并参与调节离子平衡、小分子渗调物质的合成和活性氧胁迫。这些研究结果为通过遗传工程的方法操控泛素化通路改良大豆耐盐和抗旱性提供了理论依据。2、本文克隆了1个属于SnRK2亚家族的大豆蛋白激酶基因GmPK。GmPK在大豆根、茎和叶中均有表达,但以根中的表达丰度最高,受高盐和干旱胁迫诱导表达,不受冷胁迫和ABA处理诱导表达。与野生型植株相比,过表达GmPK转基因植株中非生物胁迫应答基因(编码LEA蛋白的基因Kin1,ERD10和RD22;转录因子DREB2A及其调控的靶基因RD29b;脯氨酸合成的关键酶基因AtP5CS1)的表达水平明显增加,并且过表达GmPK转基因植株的Na+积累减少,表明GmPK可能参与调节LEA蛋白的生物合成,小分子渗调物质的合成和Na+平衡。过表达GmPK的拟南芥转基因植株的耐盐和抗旱性显著高于对照植株。这些结果表明GmPK可能通过控制一些非生物胁迫应答基因的表达提高植物的耐盐和抗旱性。3、本研究克隆一个与Na+/H+逆向转运蛋白的同源大豆基因GmNHX2,编码一条长534氨基酸的多肽,并预测有10个可能的跨膜结构域。GmNHX2在大豆的根、茎和叶中都表达,但以根中的表达丰度最高,受NaCl和PEG(polyethylene glycol)处理的诱导表达。尽管GmNHX2与LeNHX2和AtNHX2的序列相似性高于AtNHX1和AtSOS1,并且系统发育分析将GmNHX2与细胞器(液泡和囊泡)逆向转运蛋白聚成一类,但GmNHX2-EGFP(enhanced green flurescent protein)融合蛋白可能将该基因定位于植物细胞的质膜或细胞器膜上。与野生型植株相比,过表达GmNHX2的拟南芥植株在萌发期和幼苗期更耐高浓度NaCl胁迫。这些结果表明GmNHX2是一个Na+/H+逆向转运蛋白同源物,可能在盐胁迫下执行调节离子内平衡的功能。