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研究背景与研究目的龋齿和牙髓炎是临床上最常见的口腔疾病之一,通常龋齿和牙髓炎会导致牙体甚至牙髓不可逆的病损和坏死,因此牙体和牙髓组织再生一直是口腔领域研究的热点。牙髓组织位于牙齿密闭的牙髓腔内,是牙体组织中唯一的软组织。牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型,可自我更新和多向分化,有着较强的克隆能力,可分化为成牙本质细胞并最终形成牙本质。牙齿受到牙菌斑等口腔环境内的局部刺激时,内部的牙髓干细胞会分化并形成修复性牙本质从而隔绝外界刺激保护牙髓组织,而因为这种可以分化的特性,牙髓干细胞成为牙体领域的研究热点问题。牙髓牙本质复合的复合体结构的体外形成和再生便以此为理论依据。因而,深入了解这种分化再生的机制,寻找参与过程的关键信号通路和关键因子,对于牙体组织工程学来说十分关键。本研究团队通过前期对牙髓干细胞的实验研究,在健康无龋的牙髓组织和炎症牙髓组织的牙髓干细胞筛选出的众多种表达量上存在较大差异的蛋白,微管蛋白Stathmin就是被筛选出的蛋白之一。Stathmin蛋白与骨组织矿化、肿瘤细胞和细胞分裂增殖功能调节关系密切[1]。同时,Wnt/β-catenin信号通路在牙髓干细胞向分泌牙本质的细胞即成牙本质细胞分化及分裂增殖中发挥重要作用,在牙齿形成和萌出的阶段中也起到核心的调控作用。本课题组先前研究发现Stathmin可通过shh信号通路参与调控人牙髓干细胞分裂增殖和成牙本质细胞分化过程,但是否有其他信号通路参与,是否存在其他作用机制尚不明确。而目前尚未有研究报道 Stathmin 和Wnt/β-catenin通路存在相互作用,同时人牙髓干细胞分裂增殖与成牙本质细胞分化是否被这种共同彼此作用所调控,如果参与调控,其机制又如何,以上问题均未有人研究解答。本研究旨在验证LPS体外刺激人牙髓干细胞后Stathmin的表达变化,并探讨Stathmin调控人牙髓干细胞增殖与成骨/成牙向分化过程中Wn t/β-catenin信号通路所发挥的作用。材料与方法利用临床上取得的离体牙,采用改良组织块酶消化法在体外无菌环境中培养人牙髓干细胞,并对其表面干细胞标志物进行鉴定,对成骨向、成软骨向和成脂向分化潜能进行鉴定。构建慢病毒载体方法,抑制Stathmin在牙髓干细胞中的表达,并通过流式细胞分析、Cell Counting Kit-8、PCR、Western blot等方法检测抑制Stathmin表达后人牙髓干细胞分裂增殖与成牙本质细胞分化功能的变化及Wnt/β-catenin信号通路表达变化。之后,检测在抑制Stathmin表达的人牙髓干细胞后,向培养基中加入Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiC1后Wnt/β-catenin信号通路激活效果如何,以及人牙髓干细胞分化功能及分裂增殖能力是否发生改变,从而研究探讨其作用机制。结果本实验成功在离体的无菌环境中培养出状态良好的人牙髓干细胞,细胞表面的CD105、CD44、CD90、CD29为在间充质干细胞表面的四种特异性表面标记物,检测发现这四种标记物在本实验所用的人牙髓干细胞中的阳性率分别为98.66%、98.77%、99.00%和98.81%;同时目前已知的在造血干细胞表面的特异性表达的两种标记物分别为CD45、CD31,两种标记物在本实验所用的人牙髓干细胞中的阳性表达率分别为0.03%和0.09%。同时细胞具备成骨、成脂和成软骨多向分化能力,同时LPS刺激细胞后Stathmin表达量显著降低。Western blot和PCR验证Stathmin-shRNA慢病毒载体沉默Stathmin的沉默效率。相比Ctrl-shRNA组,Stathmin-shRNA组成骨向分化诱导14d后矿化结节数量明显减少,成骨/成牙相关的四种蛋白(BSP、ALP、DSPP、OCN)的表达明显降低;同时Cell Counting Kit-8与流式细胞周期分析显示,Stathmin-shRNA组细胞分裂增殖功能亦出现明显抑制。Stathmin-shRNA组Wnt/β-catenin信号通路分子Wnt5a和β-catenin的mRN、A与蛋白表达量相比Ctr1-shRNA组明显负调节。而在Stathmin-shRNA组人牙髓干细胞中添加入激活剂LiCl后,Stathmin-shRNA+LiCL组可激活Wnt/β-catenin信号通路,证明LiCl激活剂有效。Stathmin-shRNA+LiCl组矿化诱导14d后,成骨/成牙向分化相关基因的表达量较Stathmin-shRNA组呈明显的激活上升趋势;同时加入LiCl后的沉默Stathmin的人牙髓干细胞分裂增殖能力较Stathmin-shRNA组明显上调。结论本实验在离体无菌环境中成功从离体牙齿中分离出牙髓组织,并在体外无菌环境中成功培养人牙髓干细胞,且本实验所用的人牙髓干细胞经表面标记物鉴定后,证实为间充质干细胞来源,且具有克隆形成能力及向多种细胞分化能力。Stathmin对于人牙髓干细胞分裂增殖与成骨/成牙向分化有明显的正相关调控作用。而Wnt/β-catenin信号通路可能参与这种调控作用的机制。