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猪轮状病毒(Porcine Rotavirus, PRV)属呼肠孤病毒科,轮状病毒属,是引起仔猪病毒性的腹泻的主要病原之一,该病毒主要经消化道感染。4周龄以内的仔猪发病率可高达80%,死亡率可达到20%,给我国的养猪业带来了严重的危害和经济损失。近些年的研究表明猪轮状病毒非结构蛋白NSP4在病毒复制和致病过程中起着重要的作用,研究此蛋白的生物学功能对于防治此病具有重要意义。本实验中利用大肠杆菌系统可溶表达了猪轮状病毒弱毒株JL94非结构蛋白NSP4的截短片段112aa-175aa,即eNSP4,并对其第135、136和138位氨基酸进行突变,将突变前后蛋白分别腹腔注射小鼠,以PBS作为空白对照,于不同时间点观察小鼠腹泻情况,记录小鼠体重变化,对比突变前后该蛋白致腹泻能力的变化,结果表明突变后的蛋白致腹泻能力有明显增强。在此基础上,以干酪乳杆菌Lactobacillus casei393作为递呈抗原的活菌载体,利用猪轮状病毒主要免疫保护性抗原基因VP7主要中和位点和突变前NSP4为靶基因,定向插入到干酪乳杆菌表面表达和分泌型表达载体pPG-1、pPG-2,构建了pPG-1-VP7/L.casei393、 pPG-1-NSP4-VP7/L. casei393和pPG-2-NSP4-VP7/L. casei393重组乳酸杆菌系统。为进一步探索NSP4在干酪乳杆菌表达系统中能否起到免疫佐剂作用,实验将小鼠分为4组,以PBS作为空白对照组,用重组菌口服免疫小鼠,共免疫3次。免疫后于第1、2、3、5、7、9d采集血清、粪便、外生殖道冲洗液样品,检测粪便、外生殖道冲洗液样品中特异性的sIgA和血清IgG水平,并通过动物实验测定血清抗体中和突变后NSP4毒性的能力,以评价其免疫效果。检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后在小鼠粪便、外生殖道冲洗液均检测到了特异性sIgA抗体,在小鼠血清中检测到了特异性的IgG抗体。小鼠外生殖道和粪便中的sIgA以及血清IgG水平与对照组相比,均差异显著(P<0.05)。同时免疫组pPG-1-VP7/L.casei393和pPG-1-NSP4-VP7/L. casei393、pPG-1-NSP4-VP7/L. casei393和pPG-2-NSP4-VP7/L. casei393在抗体水平高峰也表现出差异,相对于重组干酪乳杆菌pPG-1-VP7/L.casei393组来说,重组干酪乳杆菌pPG-1-NSP4-VP7/L.casei393可以诱导机体产生较高的血清和黏膜抗体水平,表明突变前NSP4具有免疫佐剂作用。而pPG-2-NSP4-VP7/L.casei393与pPG-1-NSP4-VP7/L.casei393相比则可以诱导机体产生更高水平的血清和黏膜抗体,表明分泌型表达载体较表面型表达载体呈现出更好的免疫效果。中和实验结果显示,NSP4血清抗体中和肠毒素后在各个时间点小鼠的腹泻只数均少于对照组,同时小鼠平均体重增长高于对照组,说明突变前NSP4抗体可以在一定程度上中和肠毒素毒性。本实验为轮状病毒治病机制的研究提供了理论基础,为猪轮状病毒新型疫苗的研制及增强免疫效果的研究提供了一种新的思路,并奠定了一定的物质基础。