目的:　　 本研究拟采用蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导PCI2细胞损伤建立帕金森病细胞模型,探讨EGCG对lactacystin诱导损伤的多巴胺能神经元的保护作用。　　 方法:　　 第一部分:筛选lactacystin建立帕金森病细胞模型的作用剂量　　 取对数生长期的PC12细胞,设正常对照组和5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L4个lactacystin浓度组,处理后培养24h,倒置显微镜下观察不同浓度lactacystin对PC12细胞形态的影响,用MTT法测定细胞吸光度观察lactacystin对PC12细胞活力的影响,Hoechest33258荧光染色细胞核观察lactacystin对PC12细胞细胞核的影响。　　 第二部分:EGE6对lactacystin诱导损伤的PC12细胞的保护作用　　 1.了解EGCG本身对细胞是否有损伤作用　　 取对数生长期的PC12细胞,设正常对照组和1μmol/L、5μmaol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L6个EGCG浓度组,处理后培养24h,用MTT法测定细胞吸光度观察EGCG对PC12细胞活力的影响。　　 2.EGCG对lactacystin诱导PC12细胞损伤的保护作用。　　 取对数生长期的PC12细胞,设为正常对照组、lactacystin损伤组(终浓度为10μmol/L)和EGCG预处理组。EGCG预处理组,先加入不同浓度EGCG(分别为5μmol/L、10μmol/L和50μmol/L)预处理1 h,再加入lactacystin(终浓度10μmol/L)再一起共培养24 h后进行各指标检测。　　 检测指标包括:　　 (1)倒置显微镜下观察不同浓度EGCG对lactacystin诱导损伤的PC12细胞形态的影响。　　 (2)用MTT法测定细胞吸光度观察不同浓度EGCG对lactacystin诱导损伤的PC12细胞细胞活力的影响。　　 (3)用核酸特异性染料Hoechest33258染色在荧光显微镜下观察细胞核形态的变化。　　 (4)用Annexin V-FITC与PI双标细胞经流式细胞仪进一步检测细胞凋亡比例。　　 结果:　　 第一部分:Lactacystin可诱导PC12细胞损伤　　 (1)Lactacystin对PC12细胞形态变化的影响　　 正常培养PC12细胞梭型明显,细胞分布均匀。Lactacystin组PC12细胞形态发生变化,梭型细胞减少,出现球形或椭圆形细胞。球形或椭圆形数量随lactacystin作用剂量增加而增多。　　 (2)Lactacystin对PC12细胞活力的影响　　 不同浓度lactacystin(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L)作用于PC12细胞24 h后,细胞活力随浓度增加而逐渐下降,与正常对照比相比,差异均有统计学意义(P<0.05),细胞存活率分别为70.1％、59.7％、54.0％、45.8％。　　 (3)Lactacystin对PC12细胞核形态变化的影响　　 经Hoechest33258染色在荧光显微镜下观察发现正常PC12细胞细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光,而lactacystin处理组部分细胞染色质固缩,细胞核呈致密浓染,显示较强荧光,甚至可见细胞核裂解,出现致密的颗粒状荧光。　　 第二部分:EGCG对lactacystin诱导的PC12细胞损伤具有保护作用　　 1.EGCG对PC12细胞细胞活力的影响　　 不同浓度EGCG(1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)与PC12细胞共培养24h后,与正常对照组相比,1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L EGCG处理组细胞活力无明显变化(P〉0.05)。100μmol/L、20μmol/L则使细胞活力明显下降,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P〈0.05)。　　 2.EGCG对lactacystin诱导PC12细胞损伤的保护作用　　 (1)EGCG对lactacystin诱导的PC12细胞形态变化的影响　　 正常培养PC12细胞梭型明显,细胞分布均匀。Lactacystin组PC12细胞形态发生变化,梭型细胞减少,出现球形或椭圆形细胞。而EGCG预处理组显示细胞多为梭型,球形和椭圆形细胞较lactacystin组减少。　　 (2)EGCG对lactacystin诱导的PC12细胞活力的影响　　 与正常对照比相比,lactacystin组细胞存活率为(61.22土1.02)％,而5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L EG-CG预处理组细胞存活率分别上升为(66.99士1.30)％、(66.67士0.65)％、(73.4±0.67)％,EGCG预处理组细胞存活率随着EGCG浓度的增加而增加,与lactacystin组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。　　 (3)EGCG对lactacystin诱导的PC12细胞核形态的影响　　 经Hoechest33258染色在荧光显微镜下观察发现正常PC12细胞细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光,lactacystin处理组部分细胞染色质固缩,细胞核呈致密浓染,显示较强荧光,甚至可见细胞核裂解,出现致密的颗粒状荧光。与lactacystin组相比,ECJCG预处理后凋亡细胞比例降低,且胞核形态改善,荧光强度减弱。　　 (4)EOCG对lactacystin诱导的PC12细胞凋亡比例的影响　　 用Annexin V-FITC与PI双标细胞经流式细胞仪检测提示EGCG预处理组细胞的凋亡百分率降低,正常组、lactacystin组、EGCG预处理组(5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L)分别为3.0％、60.4％、59.8％、57.5％和38.6％。　　 结论:　　 1.Lactacystin对PC12细胞具有损伤作用,此作用具有浓度依赖性；　　 2.Lactacystin的毒性机制可能与其诱导细胞凋亡有关；　　 3.EGCG对lactacystin诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用。