酵母双杂交技术是近些年来发展起来的一种有效的在体内研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与RNA、蛋白质与小分子之间相互作用的技术,从这一技术建立以来,就被广泛地应用于各个领域的各种研究。半胱氨酸蛋白酶抑制剂普遍存在于动植物及微生物中,它参与生物体内信号受体的传导,蛋白酶活性的调节等生理过程。到目前为止,人们已从大豆、豇豆、马铃薯、番茄、水稻等植物中分离提取出半胱氨酸蛋白酶抑制剂,并对它们的功能进行了一定的研究。AtCYSb是拟南芥中的一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂,一些报道表明低温、干旱、高盐、氧化等胁迫可以诱导它的表达,且该基因在拟南芥中的过表达也可以提高拟南芥耐低温、干旱、高盐、氧化等胁迫的能力。但是到目前为止,我们对提高这种能力的,具体的抗逆机理及作用对象还不是很清楚,为此我们希望以AtCYSb为“诱饵”,利用酵母双杂交技术,筛选出与其具有相互作用的蛋白,并对筛选出的蛋白进行功能分析,进一步探求这种抗逆机理。本研究将AtCYSb基因和pGBKT7载体连接,构建“诱饵”表达载体pGBKT7-AtCYSb,将其转化酵母菌株Y2HGold,然后与拟南芥cDNA文库融合,利用营养缺陷型培养基筛选阳性克隆,并提取阳性酵母的总DNA,进行PCR和酶切检测,根据PCR结果和酶切结果,剔除相同的片段。将提取的pGADT7-Rec-cDNA质粒转化含“诱饵”质粒的酵母Y2HGold,进行初步共转化验证。选取可能的阳性克隆测序,对测序结果在NCBI上进行Blast比对,结果获得一个含有226个氨基酸的钙离子依赖性的核酸酶(AtCaN2),一致性达到100%。我们设计引物克隆AtCaN2全长cDNA,并构建pGADT7 AD-AtCaN2全长表达载体,将构建的全长载体转化含“诱饵”质粒的酵母菌株Y2HGold中,再次共转化验证。共转化结果表明钙离子依赖性核酸酶AtCaN2的部分序列和全长序列都可以和AtCYSb蛋白产生相互作用,激活报告基因的表达。为进一步验证“诱饵”蛋白与筛选到的蛋白之间是否存在相互作用,我们进行了体外Pull-down实验和琼脂糖凝胶电泳检测实验。Pull-down结果表明,“诱饵”蛋白AtCYSb与筛选到的蛋白AtCaN2之间存在相互作用。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,AtCYSb蛋白与AtCaN2蛋白之问存在着某种作用关系,在以λ,DNA为底物的条件下,AtCYSb蛋白对AtCaN2蛋白的活性表现出了一定的抑制作用。核酸酶AtCaN2活性检测实验表明,该核酸酶对双链DNA和单链RNA均有降解作用,并在37℃时有较高的酶活性,同时锌离子和高浓度的锰离子对该核酸酶的活性起到抑制作用,而低浓度的锰离子和镁离子对该核酸酶的活性起促进作用,另外该核酸酶适宜的pH条件为pH=7或8,是一种依赖中碱性条件的核酸酶。