捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种高致病性的吸血线虫,生活在反刍动物皱胃中。长期大量寄生会消耗宿主营养,造成养殖成本上升,甚至引起动物死亡。快速准确的诊断对捻转血矛线虫病防控非常重要,而传统的诊断方法由于检测周期长、灵敏度低、需要专业的技术人员等限制,尤其在动物早期感染和轻度感染时很难作出准确诊断,研究快速、敏感、特异的诊断方法具有重要的应用价值。近年来研究发现,捻转血矛线虫在宿主体内不同发育时期均会排泄分泌一些虫体来源的蛋白类物质,统称为排泄分泌蛋白（ESPs）。本实验室Javaid博士运用捻转血矛线虫ESPs与山羊外周血单个核细胞（PBMCs）共孵育,通过质谱（LC-MS/MS）分析,初步得到407种结合蛋白。本文从中选取了 3种进行了克隆和表达,包括甲基转移酶12型蛋白（Mt12）、延伸因子1α蛋白（EF-1α）和泛醌氧化还原酶结构域蛋白（NDUDC）;将重组蛋白的早期诊断潜力进行了分析;在此基础上建立了间接ELISA方法并进行了初步应用。研究发现,捻转血矛线虫Mt12、EF-1α、NDUDC重组蛋白均可与山羊感染捻转血矛线7天后的血清结合,具有早期诊断价值。而基于Mt12、EF-1α、NDUDC这三种重组蛋白建立了间接ELISA法、均具有较好的敏感性和特异性,将其用于临床样本检测,与剖检结果符合率达到88%以上。1捻转血矛线虫Mt12、EF-1α和NDUDC基因克隆、表达及生物信息学分析根据 Mt12（GenBank 登录号为 CDJ87424.1）、EF-1α（GenBank 登录号为CDJ84328.1）和NDUDC（GenBank登录号为CDJ88764.1）基因序列分别设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,用RT-PCR获得相应基因的开放阅读框（ORF）。回收纯化PCR扩增产物,连接pMD-19t克隆载体,选择单个菌落进行PCR和双酶切鉴定,并选择阳性质粒进行测序分析。结果表明,3个基因的ORF分别为930bp、1395bp和438bp,与参考基因序列一致。将测序分析后正确的基因片段亚克隆到pET-32a表达载体中,构建原核表达质粒pET-32a/Mt12、pET-32a/EF-1α、pET-32a/NDUDC。3种重组质粒均能在大肠杆菌BL21中表达,得到分子量分别为54kDa、68kDa与34kDa的重组蛋白。Western Blot分析结果显示,Mt12、EF-1α与NDUDC这3种重组蛋白均可被人工感染捻转血矛线虫的山羊血清特异性识别,说明这些蛋白能刺激宿主产生相应抗体,均具有较好的免疫反应性。对3种蛋白分别进行生物信息学分析,Mt12基因编码309个氨基酸,理论等电点为6.75,相对分子量为35.927kDa;Mt12是一种亲水性蛋白质（GRAVY=-0.547）该蛋白序列与GenBank中捻转血矛线虫的Mt12有100%的相似性,与巴西日圆线虫、多型螺旋线虫及胎生网尾线虫等类似物蛋白序列具有72%～94%的相似性。EF-1α基因编码464个氨基酸,理论等电点为8.95,相对分子量为50.566kDa;预测EF-1α的亲疏水性显示为亲水性蛋白质（GRAVY=-0.307）,该蛋白序列与GenBank中捻转血矛线虫的EF-1α有99%的相似性,与环纹背带线虫、锡兰钩虫、美洲板口线虫及胎生网尾线虫等类似物蛋白序列具有93%～98%的相似性。NDUDC基因大小为438 bp,编码含有145个氨基酸,理论等电点为11.06,相对分子量为17kDa;预测NDUDC是亲水性蛋白质（GRAVY=-0.861）,该蛋白序列与GenBank中捻转血矛线虫的NDUDC有100%的相似性,与秀丽隐杆线虫、锡兰钩虫多及环纹背带线虫等类似物蛋白序列具有71%～86%的相似性。2 Mt12、EF-1α和NDUDC早期诊断潜力分析用捻转血矛线虫第三期幼虫人工感染山羊,采集山羊不同时期（0天、7天、14天、28天、35天、49天、61天、80天及103天）的血液制备血清,以山羊不同感染时期的血清作为一抗,分别对Mt12、EF-1α、NDUDC这3种重组蛋白进行Western Blot分析。发现,EF-1α、NDUDC重组蛋白都能够和感染捻转血矛线虫后7～103天的山羊血清结合;Mt12蛋白被识别的时期是山羊感染后的7～61天。说明捻转血矛线虫Mt12、EF-1α和NDUDC蛋白具有潜在的早期诊断价值。3基于Mt12、EF-1α和NDUDC蛋白间接ELISA检测方法的建立本试验以Mt12、EF-1α和NDUDC这3种重组蛋白作为包被抗原,分别建立间接ELISA检测方法。对其抗原包被条件、血清反应条件、封闭条件、二抗作用条件及临界值等条件分别进行摸索,确定间接ELISA最佳的反应条件。结果显示,Mt12蛋白间接ELISA最佳的反应条件为:包被浓度1.25μg/mL,血清稀释度为1:25;一抗最佳作用时间为60min;用5%牛血清白蛋白37℃封闭2h;二抗以1:8000稀释37℃反应60min,本试验检测样品的阳性临界值为0.40,阴性临界值为0.36,在二者之间（0.36<OD450<0.40）为假阴/阳性。EF-1α蛋白最佳的反应条件为:包被浓度1.25μg/mL,血清稀释度为1:25;一抗最佳作用时间为60min;用5%牛血清白蛋白37℃封闭2h;二抗以1:8000稀释37℃反应60min;检测样品的阳性临界值为0.40,阴性临界值为0.35,在二者之间（0.35<OD450<0.40）为假阴/阳性。NDUDC蛋白最佳的反应条件为:包被浓度0.625μg/mL,血清稀释度为1:25;一抗最佳作用时间为90min;用5%牛血清白蛋白37℃封闭2h;二抗以1:8000稀释37℃反应90min,检测样品的OD450≥0.36时,判定为阳性,反之则为阴性阳性临界值为0.36,阴性临界值为0.32,在二者之间（0.32<OD450<0.36）为假阴/阳性。经特异性试验得知以纯化的3个重组蛋白分别为包被抗原能特异性地检测出山羊感染捻转血矛线虫的血清,经重复性试验可知所建立的检测方法均具有良好的重复性。4间接ELISA与剖检等方法比较为评估所建立的ELISA方法在临床检测中的应用效果可行性,在江苏省南京市不同羊场随机选取51只山羊,采集其血清、粪便和皱胃样品。对这些样品分别进行虫卵计数、皱胃成虫计数和间接ELISA检测,比较三种诊断方法结果。皱胃剖检显示阳性样品为10份,阴性样品为41份。基于Mt12蛋白建立的ELISA方法检测到山羊感染捻转血矛线虫的阳性样品10份,40份样品为阴性,1份样品为假阴/阳性;基于EF-1α蛋白建立的ELISA方法检测到的阳性样品8份,37份样品为阴性,6份样品为假阴/阳性;基于NDUDC蛋白建立的ELISA方法检测到的阳性样品7份,39份样品为阴性,5份样品为假阴/阳性。粪检结果显示8份样品为阳性,43份样品为阴性。基于Mt12、EF-1α和NDUDC这三个重组蛋白建立的间接ELISA检测结果与剖检结果相比符合率分别为98%、88%与90%。