论文部分内容阅读
背景:卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤,其死亡率一直高居妇科恶性肿瘤的首位。目前主要的治疗方式为肿瘤细胞减灭术及以铂为基础的一线化疗。尽管初始化疗的有效率为70%,但大多数晚期卵巢癌患者最终因化疗耐药而复发。近年来,肿瘤的靶向治疗取得较大进展,根据临床前和临床数据表明,抗血管生成药物与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase,PARP]抑制剂的联合应用能明显改善卵巢癌患者的预后。现有机制研究表明抗血管生成药物通过诱导瘤内缺氧状态,下调同源重组（HR）相关基因,使得HR缺陷,从而增强了PARP抑制剂的敏感性。此外,PARP1本身也在血管生成和缺氧反应中起作用。自噬是真核细胞普遍存在的分解代谢过程。近年来,越来越多的证据表明,自噬与药物的多重耐药性（Multiple drug resistance,MDR）密切相关。有相关文献报道,抗血管生成药物阿帕替尼（Apatinib）可以通过激活自噬提高肿瘤细胞对阿帕替尼的耐药性。同样,PARP抑制剂奥拉帕利（Olaparib）在肿瘤的治疗过程中也诱导了自噬的增加,进而增加了奥拉帕利的耐药性。这提示阿帕替尼和奥拉帕利各自都可引起自噬的变化。临床试验显示,在卵巢癌中,抗血管生成药物联合PARP抑制剂较单药治疗相比,疗效提高,但自噬在二者联合应用中的机制尚不清楚,自噬在其中起到的作用值得探讨。目的:本研究拟探讨自噬在抗血管生成药物阿帕替尼联合PARP抑制剂奥拉帕利在卵巢癌细胞中的作用及其发挥作用的分子机制,进一步为寻找联合用药的优势人群、逆转耐药提供理论基础。方法:本研究采用人源卵巢癌细胞A2780、OVCAR3、SKOV3、SNU119作为实验模型1.细胞系对单独用药的反应:通过MTT法检测阿帕替尼和奥拉帕利单药对卵巢癌细胞增殖的作用。2.细胞系对联合用药的反应:利用MTT法、克隆形成实验、划痕愈合实验、Hoechst 33258染色法及蛋白质免疫印迹（Western blot）检测阿帕替尼联合奥拉帕利对卵巢癌细胞增殖、迁移和凋亡的作用。3.联合用药的机制研究:利用Western blot和吖啶橙染色法检测联合用药对自噬和DNA损伤及修复的作用,并且利用3-MA和Rapa干预自噬,检测自噬对细胞增殖、迁移、DNA损伤及修复的作用。4.联合用药引起自噬差异的分子机制研究:利用Western blot检测四种卵巢癌细胞p53的表达情况,并基于GEPIA2数据库分析p53在卵巢癌中的表达、预后及与自噬的相关性,并干预p53检测自噬相关蛋白的表达。结果:1.阿帕替尼联合奥拉帕利与单独用药相比明显抑制A2780细胞的增殖、迁移并使凋亡增加,而对OVCAR3细胞的作用不明显。2.联合用药与单独用药相比能明显抑制A2780细胞的自噬,表现为自噬溶酶体数量降低及自噬相关蛋白LC3、ATG5的降低和p62的升高;而联合用药明显升高了OVCAR3细胞的自噬。3.联合用药明显升高A2780细胞的DNA损伤标志物γ-H2AX的蛋白表达并降低了DNA修复蛋白BRCA1的表达;而降低了OVCAR3细胞的γ-H2AX的表达并升高了BRCA1的表达。4.在A2780细胞中使用Rapa和OVCAR3细胞中使用3-MA干预自噬后,卵巢癌细胞的增殖、迁移、DNA损伤及修复相关指标被逆转,表明自噬对其有调控作用。5.Western blot显示p53在A2780和SKOV3细胞中高表达;在OVCAR3和SNU119细胞中低表达。GEPIA2数据库显示p53高表达的卵巢癌患者的预后更好,并且p53与自噬呈负相关。进一步使用p53激活剂RITA在低表达p53的OVCAR3细胞中激活p53,自噬相关蛋白表达降低。结论:1.联合应用抗血管生成药物阿帕替尼和PARP抑制剂奥拉帕利可抑制p53野生型卵巢癌细胞A2780的增殖、迁移,并诱导凋亡增加,但对p53突变型卵巢癌细胞OVCAR3的作用不明显。2.阿帕替尼联合奥拉帕利在A2780细胞中通过抑制自噬抑制了DNA损伤修复,而在OVCAR3细胞中通过激活自噬促进了DNA损伤修复。3.p53的表达水平是引起自噬差异的分子基础,p53可能成为预测阿帕替尼和奥拉帕利联合治疗反应的生物标志物。