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开心散是唐宋以来中医传统益气养心、安神定志的代表方和基本方,为多家重要方书所收载,它由远志、人参、茯苓和石菖蒲四味药组成。本课题组前期针对开心散在治疗中医情志病(主要以抗抑郁和增强学习记忆能力)的作用和机制方面进行了大量的研究工作。在多个经典的抗抑郁模型上开心散都表现出了明显的抗抑郁作用,本次研究前期再次验证了开心散在绝望模型上的抗抑郁作用和对小鼠海马中环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element bingding pretein,CREB)相关蛋白的影响,更为有意义的是进一步发现了开心散提高脑内5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)与脑源性神经营养因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)的相关性,为开心散调控5-HT-CREB-BDNF神经通路的研究给予了有力的铺垫。鉴于开心散成分的复杂性,前期课题组力图筛选发现开心散中参与5-HT-CREB-BDNF通路抗抑郁的活性成分,研究发现3,6’-二芥子酰基蔗糖(3,6’-disinapoyl sucrose, DISS)在众多成分中脱颖而出,具有明显的抗抑郁作用,可改善抑郁小鼠行为学指标,增强5-HT系统功能,对慢性应激大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal cortex axis, HPA)激素水平具有调节作用,增加抑郁动物海马中磷酸化CREB表达,并能提高CREB下游靶基因BDNF的mRNA及蛋白的表达。为进一步研究DISS通过神经保护作用发挥抗抑郁的细胞分子机制,特别是参与5-HT-CREB-BDNF生物通路的具体靶点,本实验以该通路关键靶点CREB及其下游相关营养因子BDNF为核心,采用CREB上游相关通路拮抗剂,围绕DISS参与启动CREB磷酸化通路,促神经保护作用进行了初步的分析和研究。1开心散对小鼠抑郁行为和海马中脑源性神经营养因子的影响将小鼠随机分为空白对照组、盐酸氟西汀组、开心散不同剂量组,连续灌胃7天,末次给药1h后进行小鼠悬尾实验,高效液相色谱法测定小鼠全脑中去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、多巴胺(dopamine, DA)、5-HT的含量,蛋白印迹法检测小鼠海马中CREB,p-CREB, BDNF的蛋白含量,RT-PCR法测定小鼠海马中BDNF mRNA的含量,结果发现开心散可明显缩短小鼠悬尾不动时间,增加脑内单胺类递质(DA和5-HT)和海马中CREB、p-CREB、BDNF的含量,并发现开心散抗抑郁作用与海马中BDNF水平呈良好相关性。2DISS对SH-SY5Y细胞增殖及CREB活化的影响体外培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),基于本室细胞特性,用CCK-8法测定不同密度细胞的生长曲线,筛选最佳种板密度；采用空白培养基饥饿的方法建立细胞损伤模型,检测不同浓度DISS给药不同时间后对细胞存活率和细胞凋亡的影响。研究发现,与空白培养基损伤的模型组相比,DISS(6,10,30,60μmol·L-1)作用24h后可以明显提高细胞存活率,降低细胞凋亡比率,在一定浓度范围内具有浓度依赖性,提示DISS可能参与细胞抗凋亡的调节,通过抑制细胞凋亡来发挥细胞保护作用。采用蛋白印迹法(Western Blot)检测不同浓度DISS对胞内p-CREB,CREB和BDNF表达的影响。结果发现,与对照组相比,DISS (60μmol·L-1)给药10-30mmin时可以增加p-CREB的表达和p-CREB/CREB的比值；CREB在给药一小时内表达无显著性差异,给药10min后可增加胞内BDNF的表达(P<0.05),该结果表明DISS可能是通过促进CREB活化,增加下游相关营养因子BDNF的表达而发挥神经保护作用的。借助CERB上游通路相关拮抗剂：蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)拮抗剂、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calcium and calmodulin-dependent protein kinase,CaMKⅡ)拮抗剂、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)拮抗剂、酪氨酸蛋白激酶B(tropomyosin-related kinase B,TrkB)拮抗剂、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)拮抗,制作细胞拮抗模型,再给予DISS作用15min,用Western Blot方法检测拮抗前后细胞内CREB、p-CEEB和BDNF的表达变化。结果显示,与对照组相比,各拮抗组细胞内p-CREB、CREB.BDNF的表达都明显降低(P<0.05)；与直接给药组(DISS组)相比,给予CaMKII, ERK,TrkB拮抗剂后的DISS给药组细胞内p-CREB和BDNF表达明显降低,揭示DISS发挥神经保护的作用机制可能与CaMK通路、ERK通路相关。3DISS对CREB上游相关通路蛋白的影响采用Western Blot法检测DISS给药不同时间后对胞内TrkB, CaMKII,p-CaMKII,ERK,p-ERK,PKA,p-PKA和PI3K表达的影响。结果发现,与对照组相比,DISS给药10min-1h时可以增加p-CaMKⅡ的表达,给药10min时效果最明显；DISS给药1h、4h时可增加胞内CaMKⅡ、ERK的表达(P<0.05);与对照组相比,PKA,p-PKA,TrkB和PI3K表达变化与DISS给药时间无明显相关性。Western Blot法检测CaMK通路、ERK通路间的相关性。借助通路拮抗制作细胞拮抗模型,再给予DISS保护,用Western Blot方法分别检测拮抗前后细胞内CaMKⅡ,p-CaMKⅡ,ERK, p-ERK和TrkB的表达变化。结果显示,与对照组细胞相比,给予相关拮抗剂后胞内各相关通路靶点蛋白表达无显著性差异；与DISS组相比,KN93拮抗+给药组细胞内ERK表达明显降低,推测ERK位于CaMKII通路下游。4DISS对细胞内钙离子和CRE表达活性的影响采用流式细胞仪和钙离子荧光探针Fluo-4AM检测不同DISS浓度给药不同时间后对胞内钙离子浓度的影响,结果显示DISS (30,60μmol·L-1)给药5-30min内可不同程度增加胞内钙离子浓度,30mmin时胞内钙离子浓度最高,之后恢复给药前水平,DISS (100μmol·L-1)给药后胞内钙离子浓度无明显变化,说明DISS在一定浓度内短时间给药可打开钙离子通路,促进钙离子内流,并不是无限制增加钙离子浓度,高浓度DISS无此作用。采用双荧光素酶报告基因法检测DISS对H89,KN93,U0126拮抗前后细胞内CRE基因表达活性的影响,forskolin为阳性药。结果发现,与对照组相比,DISS组细胞中CRE表达明显增加；与DISS组相比,给予KN93,U0126后的DISS给药组细胞内CRE活性明显降低,提示DISS发挥神经保护作用机制可能与通过CaMK通路、ERK通路调节神经细胞中CRE表达有关。综上所述,我们推测DISS可通过CaMK通路、ERK通路促进CRE的活化,增加p-CREB的表达,磷酸化的CREB进一步促进BDNF的表达,最终影响神经细胞的神经可塑性、神经分化、神经营养、细胞生存与凋亡、细胞氧化应激功能等,发挥抗抑郁作用。