背景与目的:荨麻疹（urticaria）是由于皮肤、黏膜小血管扩张及渗透性增加而出现的一种局限性水肿反应,通常在1-24小时内消退。临床上常表现为先有皮肤瘙痒,随即出现风团。慢性荨麻疹（chronic urticaria,CU）是以病程≥6周的反复发作的风团、瘙痒伴或不伴有血管性水肿为特征的疾病。根据风团是否为自发性出现的或是否由物理性刺激引起的,可将CU分为慢性自发性荨麻疹（chronic spontaneous urticaria,CSU）和慢性诱导性荨麻疹（chronic inducible urticaria,CInd U）。症状性皮肤划痕症（symptomatic dermographism,SD）,亦称人工荨麻疹,是CInd U中最主要的一种亚型,以剪切力（例如摩擦或抓挠）引起的条带状风团伴瘙痒为特征。通过完整的病史和皮肤划痕试验可对SD进行诊断,但有时也存在与CSU难以相鉴别的临床病例。SD人群发病率约为1-5%,平均病程长达6年。由于日常生活中不可避免的物理性刺激,SD对患者的生活质量造成了严重的影响。尽管荨麻疹是一种非常常见的疾病,但是它的发病机制仍不明确。目前普遍认为肥大细胞（mast cell,MC）和嗜碱性粒细胞是荨麻疹的主要效应细胞,MCs和嗜碱性粒细胞的活化及活化后组胺和其他促炎介质的释放是荨麻疹病理生理反应中最重要的环节。免疫球蛋白Ig E的Fc段与MCs表面的Ig E高亲和力受体（FcεRI）的结合则在MCs活化中起核心作用。此外,Ig E并非是介导MCs活化脱颗粒的唯一刺激物,Ig G抗体及补体成分（C3a与C5a）等大量的刺激物可以直接触发MCs脱颗粒。然而,目前尚不明确物理性刺激是如何激活皮肤中的MCs或血液中的嗜碱性粒细胞的。以往的一些研究结果表明大部分SD患者血清中总Ig E水平升高,特异性Ig E和被动转移试验呈阳性,属于Ig E依赖型变态反应。尽管SD早在一个世纪前就被首次报道过,但关于SD的研究在国内外都比较少,缺乏能鉴别SD和CSU的辅助诊断生物标志物及客观地反映SD的疾病活动度和治疗反应的血清生物标志物,并且目前为止还没有研究团队探索过SD的具体发病机制。MicroRNA（miRNA）是非编码单链RNA,参与转录后基因表达的调控。miRNAs在体液中可保持稳定,且在许多研究中都被用作生物标志物。我们的近期研究表明miR-125a-5p和CCL17可作为反映CSU疾病活动度和治疗反应的血清生物标志物。此外,以往的研究发现一些miRNAs通过PI3K/Akt信号通路影响了Ig E介导的MCs的脱颗粒程度。然而,目前还没有研究团队针对miRNAs在SD中发挥的作用展开研究。本研究第一部分的主要目的是筛选并验证活动期SD患者血清中异常表达的miRNAs,并比较活动期及缓解期SD患者血清中上述miRNAs的表达水平,以评估其作为生物标志物的潜力。其次,预测异常表达miRNAs的靶基因,并检测活动期以及缓解期SD患者血清中该靶基因同源蛋白的表达水平;第二部分的主要目的是探索在SD患者中异常表达的miRNAs是否通过调节Ig E介导的MCs脱颗粒程度参与SD的病理生理过程,从而为SD的发病机制以及分子靶向治疗研究提供新的方向。方法:第一部分:SD患者的血清样本来源于中国医科大学附属第一医院皮肤科荨麻疹专病门诊,共纳入55名活动期SD患者、46名活动期CSU患者以及52名与入组的荨麻疹患者年龄性别相匹配的健康对照（healthy controls,HCs）。SD与CSU患者的诊断及治疗方案依据荨麻疹国际诊疗指南。当患者停药后持续至少4周未出现荨麻疹的症状和体征时则认为其处于完全缓解状态,此时收集患者的血清作为该患者的缓解期样本。初筛阶段采用Taq Man Human miRNA Array检测10名活动期SD患者与10名HCs的血清miRNAs表达水平,并通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）技术对显著差异表达的miRNAs在45名活动期SD患者与42名HCs中的表达水平进行验证,并检测10名缓解期SD患者的血清中上述miRNAs的表达水平。利用Target Scan、Diana-micro T、miRDB、star Base和Tar Base在线数据库并结合以往研究结果预测差异表达miRNAs的靶基因,同时采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测55名活动期SD患者、10名缓解期SD患者、46名活动期CSU患者以及52名HCs的血清中差异表达miRNAs靶基因的同源蛋白以及CCL17水平。血清miRNAs初筛实验数据采用归一化方法处理,验证实验数据采用cel-miR-39归一化,miRNAs的相对表达量用2-ΔCt表示。对于非正态分布连续变量,我们采用中位数（四分位间距）表示,并采用Mann-Whitney U检验进行比较;非参数Wilcoxon符号秩检验用于分析配对样本数据;Fisher’s精确检验用于分析定性数据;Spearman’s等级顺序相关系数用于分析miRNAs与预测的靶基因之间的潜在相关性;利用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线和ROC曲线下方的面积大小（areas under curve,AUC）对miRNAs的诊断性能进行评价。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。第二部分:选用大鼠嗜碱性细胞白血病细胞系RBL-2H3（目前最广泛用于MCs研究的细胞系）作为研究对象。利用抗二硝基苯酚（dinitrophenol,DNP）-Ig E与DNP-牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）建立RBL-2H3细胞脱颗粒模型;采用比色测定法检测RBL-2H3细胞的β-氨基己糖苷酶释放率,采用ELISA法检测RBL-2H3细胞上清的组胺水平,采用流式细胞术检测RBL-2H3细胞活化相关膜标记物CD63表达水平,并通过上述三种方法对RBL-2H3细胞的脱颗粒程度进行评估。采用q RT-PCR技术分别检测处于活化状态与静息状态的RBL-2H3细胞的miRNAs表达水平。利用Lipofectamine 3000转染试剂向RBL-2H3细胞中转染miRNAs模拟物/抑制物,构建miRNAs过表达/低表达的RBL-2H3细胞模型,并通过计算差异倍数值（fold change）评估转染效率。对于正态分布连续变量,我们采用平均值±标准差表示,并采用student’s t检验进行比较。结果:第一部分:1、血清miRNA qPCR-based array初筛实验结果显示共有59个显著差异表达的miRNAs(2|-ΔΔCt|＞2且P＜0.05),我们筛选出了10个可能与免疫性疾病相关的miRNAs进行验证实验;其中,血清miR-125a-5p的表达水平在活动期SD患者中显著上调,而miR-185-5p、miR-590-5p、miR-301a-3p、miR-16-5p、miR-30e-3p、miR-126-3p、miR-20b-5p、miR-195-5p和miR-18a-5p的表达水平则显著下调。2、血清miRNA q RT-PCR验证实验结果显示在初筛实验中差异表达的10个miRNAs中仅miR-126-3p和miR-16-5p的血清表达水平在活动期SD患者中显著下调（P＜0.0001）,其余8个miRNAs的血清表达水平在SD患者与HCs之间并未存在统计学差异。3、在活动期SD患者中,miR-126-3p和miR-16-5p的AUC值分别为0.769和0.789,其中miR-126-3p的敏感度和特异度分别为68.2%和76.2%,miR-16-5p的敏感度和特异度分别为65.9%和81.0%;此外,我们利用Logistic回归模型构建了miR-126-3p和miR-16-5p联合诊断SD模型,这两个miRNAs的联合诊断模型的AUC值为0.796。相比于上述两个miRNAs单独作为诊断SD指标的AUC值,联合诊断模型的AUC值有所提升,拥有更高的诊断效能。4、根据性别、年龄、是否伴有血管性水肿、是否有特应性疾病个人史、是否有荨麻疹家族史、是否有特应性疾病家族史、血清总Ig E水平是否异常、血清特异性Ig E是否为阳性以及病情完全控制时的药量对SD患者进行分组,miR-126-3p在45岁以上的SD患者中的血清表达水平显著下调（P=0.008）;此外,相比于血清特异性Ig E为阳性的SD患者,特异性Ig E为阴性的SD患者的血清miR-126-3p（P=0.020）与miR-16-5p（P=0.0004）具有更低的表达水平;其他组间的上述两个miRNAs的血清表达水平未见统计学差异。5、利用在线数据库预测miRNAs的靶基因,得到17个miR-126-3p和miR-16-5p的共同的潜在靶基因,包括血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A）和磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1,PIK3R1）等。上述17个潜在靶基因中仅VEGF-A的同源蛋白为血清中可检测的分泌性蛋白且以往的研究表明VEGF-A与CU高度相关;此外,已有研究证实miR-126-3p和miR-16-5p与VEGF-A具有靶向关系,因此我们选择在SD患者的血清中检测VEGF-A水平从而评估VEGF-A作为生物标志物的潜力。此外,以往的研究表明PIK3R1在PI3K/Akt信号通路中发挥关键作用,PI3K/Akt信号通路则是Ig E介导的MCs活化过程中重要的通路之一,且已有研究证实miR-126-3p和miR-16-5p与PIK3R1具有靶向关系,因此我们猜测miR-126-3p和miR-16-5p可能通过靶向PIK3R1调控PI3K/Akt信号通路进而影响Ig E介导的MCs脱颗粒程度。6、血清VEGF-A水平在活动期SD患者中显著升高（P=0.0001）,在活动期CSU患者中无统计学差异;VEGF-A在SD患者中的AUC值为0.732,敏感度和特异度分别为71.1%和69.1%;此外,血清VEGF-A水平分别与血清miR-126-3p（Spearman rho=-0.587,P＜0.0001）和miR-16-5p（Spearman rho=-0.458,P=0.0018）表达水平呈现显著负相关。7、血清CCL17水平在活动期SD患者与HCs之间未见统计学差异。8、与活动期SD患者相比,血清miR-126-3p（P=0.0039）和miR-16-5p（P=0.0020）的表达水平在缓解期SD患者中显著上调,血清VEGF-A水平显著下降（P=0.0059）。第二部分:1、与静息状态的RBL-2H3细胞相比,Ig E介导脱颗粒的RBL-2H3细胞的β-氨基己糖苷酶释放率、上清组胺水平与活化相关膜标记物CD63表达水平显著升高（P＜0.0001）。2、miR-126-3p和miR-16-5p的表达水平在Ig E介导脱颗粒的RBL-2H3细胞与静息状态的RBL-2H3细胞之间无统计学差异。3、与对照组相比,miR-126-3p模拟物和抑制物转染RBL-2H3细胞的平均差异倍数值分别为219.3和23.6（P＜0.0001）;miR-16-5p模拟物和抑制物转染RBL-2H3细胞的平均差异倍数值分别为5.2和15.1（P＜0.0001）。4、miR-126-3p或miR-16-5p过表达/低表达的RBL-2H3细胞经Ig E介导脱颗粒后的β-氨基己糖苷酶释放率、上清组胺水平以及膜CD63表达水平与对照组相比无统计学差异。结论:1、miR-126-3p和miR-16-5p可以作为潜在的血清生物标志物,用于SD与CSU的鉴别诊断并反映SD的疾病活动度和治疗反应。2、VEGF-A可作为反映SD的疾病活动度和治疗反应的潜在的血清生物标志物。3、SD与CSU之间观察到的完全不同的血清miRNAs表达谱提示SD与CSU之间存在不同的发病机制。4、miR-126-3p和miR-16-5p可能通过靶向VEGF-A在SD的发病机制中发挥作用。5、Ig E介导的MCs脱颗粒不会导致MCs的miR-126-3p和miR-16-5p表达水平改变。6、miR-126-3p或miR-16-5p过表达/低表达对Ig E介导的MCs脱颗粒程度不造成影响。7、miR-126-3p与miR-16-5p可能通过调节非Ig E介导的MCs脱颗粒参与SD的病理生理过程。