金纳米粒子对PCR特异性扩增的效应及ACC的液相色谱测定

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聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)又称体外扩增技术,是现代分子生物学研究的常用的重要手段。在过去的几十年,PCR技术在分子遗传学取得革命性的突破,广泛用于分子生物学和医学领域。鉴于PCR产物累积呈几何级数增长的特性,PCR技术具有较高的灵敏性,扩增条带可用于DNA序列分析、分子诊断和遗传分析,然而PCR非特异性扩增限制了PCR技术的发展。最近,人们试图从新兴学科与技术中寻找优化PCR的方法。纳米科学技术和生物科学技术相结合的纳米生物技术由于其独特的优势性越来越引起人们的关注。金纳米粒子的粒径尺寸约几纳米到几十纳米左右,稳定性好,而且具有良好的生物相容性、独特的光电性质,在生物领域得到广泛应用。近几年已有相关文献报道,金纳米粒子或量子点能够减少PCR的非特异性扩增,使特异性扩增得到增强。但是研究仅限于金纳米粒子在短链目的条带(小于1000bp)不同链长DNA的特异性扩增的影响,而对长链目的条带(大于1000bp)的影响还未见报道,基于此,我们探索了金纳米粒子对PCR长链产物1100bp和2500bp的特异性扩增影响。乙烯是调节植物生长、发育和衰老的主要植物激素。植物通过一系列基因的表达,最后由乙烯调控水果的成熟,所以说研究乙烯含量的变化在农业方面具有重要的生理学意义。1-氨基环丙烷-l-羧酸是乙烯生物合成的直接前体,与植物体内一系列生理变化反应关系密切,所以研究植物组织或器官ACC的含量可以更好的理解乙烯在植物生理学上的调控机制。植物体内ACC含量的测定一般通过NaClO-饱和的NaOH溶液氧化,但是这种方法存在转化率低且不确定、样品消耗量大等缺点,因此本文详细描述了以HPLC为基础,结合荧光检测器,建立了一种简便、快速和直接测定植物组织中微量ACC含量的新方法。该方法是基于用荧光胺作为柱前衍生化试剂,在pH=8.0的硼酸缓冲溶液中反应,产生强荧光性的产物。各种影响衍生化反应效率的实验条件通过荧光分光光度法优化得到。对于实际样品的检测,桃和苹果中提取得到的ACC没有进行进一步的纯化,其衍生化产物通过高效液相色谱C18柱结合荧光检测器成功分离。在检测ACC时,其他存在果实中可能干扰ACC检测的多种氨基酸在本实验中进行了研究,能够很好和ACC色谱峰分开,不会影响ACC的检测。在ACC浓度为横坐标(浓度范围23.82-238.82μg·L-1)和衍生物色谱峰积分面积为纵坐标时,做标准曲线,其线性相关性很好,相关系数为0.9997。在信噪比为3时,计算得到其最低检测限为5.0μg·L-1。本实验方法成功检测了桃和苹果中的ACC含量时,其加标样品回收率为90.89-104.4%,相对标准偏差为0.19-1.9%。该方法在果实中研究ACC代谢活动具有重要的意义。
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