目的:糖尿病视网膜病变是糖尿病患者常见的并发症,随着糖尿病病程延长以及血糖升高,视力逐渐或突然下降,严重情况会导致失明,其中视网膜神经节细胞凋亡和微血管病变是主要发病原因。糖尿病可诱导神经节细胞等细胞的神经凋亡,这些改变可能与小胶质细胞反应性变化、神经保护因子减少等多种因素相关。糖尿病患者中存在神经节细胞层、内丛状层变薄现象,甚至在可见的微血管病变出现之前,就已经发生明显的区域性缺失。因此研究有效的糖尿病视网膜病变视网膜神经保护治疗具有重大的实际临床意义。JQ1是一种溴结构域外末端蛋白抑制剂,对肿瘤细胞增殖、炎症和心血管疾病具有非常明显的治疗作用,但在糖尿病视网膜病变中的应用尚无报道。本研究通过实验动物体内和体外细胞实验,探讨JQ1对视网膜神经节细胞凋亡及炎性因子的影响,提出假说并深入分析其分子机制。研究方法:1.通过腹腔注射链脲佐菌素构建SD大鼠糖尿病模型,模型建立后,实验动物分为三组:正常对照组:健康SD大鼠,双眼玻璃体腔注射10%二甲基亚砜+磷酸盐缓冲溶液,糖尿病大鼠右眼为实验组:玻璃体腔注射10%二甲基亚砜+磷酸盐缓冲溶液,左眼为治疗组:玻璃体腔注射10%二甲基亚砜+JQ1。注射后分别在第1天,第3天,第7天,第14天进行大鼠眼球标本采集,制作视网膜切片,DAPI染色,观察高糖环境下视网膜神经节细胞丢失状况,并对视网膜神经节细胞的特异性标志蛋白NRN1、SNCG、Thy1,炎性因子RANTES、TNF-α,凋亡因子相关蛋白Caspase-3及m RNA表达水平进行Western blotting和实时定量荧光PCR检测,探讨JQ1对糖尿病视网膜病变大鼠神经节细胞的保护作用。2.生物信息学分析糖尿病患者与健康人群差异基因表达情况,GO和KEGG分析基因和通路富集情况。利用链脲佐菌素建立的糖尿病视网膜病变动物模型,对照组和糖尿病组大鼠玻璃体腔内注射JQ1,分别在第1天、第3天、第7天取大鼠眼球,甲醛固定,视网膜进行苏木精-伊红染色法染色,光学显微镜下观察视网膜结构并对视网膜神经节细胞层细胞数目进行计数。为进一步验证JQ1对视网膜的保护作用,免疫荧光染色观察视网膜的PI3K磷酸化水平。3.体外建立BV2小胶质细胞高糖模型,利用细胞划痕实验和Transwell实验,对实验细胞进行光学显微镜观察记录,并利用软件分析JQ1对细胞迁移和侵袭能力的影响。从蛋白质层面Western blotting检测各组细胞中PI3K/AKT通路蛋白p-PI3K、total-PI3K、p-AKT、total-AKT、MMP2、MMP9表达水平,并利用免疫荧光染色分析各组细胞PI3K磷酸化水平,深入探究JQ1发挥功效的分子信号通路。结果:1 DAPI染色结果表明,高糖刺激导致STZ诱导的SD糖尿病大鼠视网膜神经节细胞层变薄,细胞死亡,细胞数明显减少,JQ1玻璃体腔注射组视网膜神经节细胞死亡数目有所减少,说明糖尿病视网膜病变大鼠诱导视网膜神经节细胞死亡,而JQ1玻璃体腔注射可以改善这一状况。糖尿病视网膜病变模型组的视网膜神经节细胞明显少于正常对照组,而JQ1玻璃体腔注射组细胞较STZ诱导的SD糖尿病大鼠模型组细胞相比增多,且差异具有统计学意义（P﹤0.05）。结果表明STZ诱导的SD糖尿病大鼠视网膜神经节细胞明显减少,而应用JQ1后可缓解视网膜神经节细胞的丢失。利用Western blotting分析各组RANTES、TNF-α、Caspase3表达变化,结果发现,RANTES、TNF-α、Caspase3变化趋势一致,与正常对照组相比糖尿病组大鼠RANTES、TNF-α、Caspase3水平显著升高,经JQ1玻璃体腔注射后,上述指标均有所降低,其中TNF-α降低幅度最大。而且随时间延长RANTES、TNF-α、Caspase3表达水平略微降低。利用实时定量荧光PCR进行检测各组大鼠视网膜在玻璃体腔注射后第1天,第3天,第7天的视网膜神经节细胞的特异性标志蛋白NRN1、SNCG、Thy1 m RNA表达水平变化,结果表明随时间延长各组内NRN1、SNCG、Thy1变化差异不显著。糖尿病视网膜病变组NRN1、SNCG、Thy1的m RNA表达明显下降,JQ1组次之,正常对照组最高,组间且差异显著,具有统计学意义（P﹤0.05）。糖尿病视网膜病变大鼠通过玻璃体腔注射JQ1后,可上调视网膜神经节细胞中NRN1、SNCG、Thy1基因表达,进而缓解糖尿病视网膜病变引发的神经节细胞损伤。2生物信息学分析结果表明NTRK2在糖尿病患者中显著高表达,基于KEGG数据库进一步分析JQ1对糖尿病患者通路影响,主要富集于PI3K/AKT通路。视网膜石蜡切片HE染色形态学观察玻璃体腔注射后第1天,第3天,第7天的节细胞层,经细胞计数分析,随时间推移正常对照组节细胞层细胞数量变化不大,看出糖尿病组视网膜节细胞层细胞数量较正常对照组细胞数量明显减少,而经过JQ1玻璃体腔注射后第1天,第3天的视网膜细胞数量无明显变化,随着时间推移,第7天的略有所增加。糖尿病组明显降低,而经JQ1注射组,节细胞层细胞数量降低幅度小于糖尿病组,并且在7天后节细胞层的细胞数量有所回升（P<0.01）。为了进一步验证JQ1对视网膜的保护作用,通过免疫荧光染色观察了视网膜的PI3K磷酸化水平。正常对照组视网膜PI3K磷酸化水平很低,糖尿病组PI3K磷酸化水平显著升高,JQ1治疗组可一定程度降低PI3K磷酸化水平,绿色阳性细胞数明显减少。利用Western blotting分析各组大鼠视网膜组织中PI3K/AKT信号转导通路及其相关蛋白表达水平,结果表明相比对照组,糖尿病组和JQ1治疗组p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT,MMP2以及MMP9表达均呈升高趋势（P<0.01）,而JQ1治疗组视网膜组织中上述蛋白表达水平较STZ诱导的SD糖尿病大鼠组显著降低（P<0.01）3划痕实验和Transwell实验结果表明随培养时间延长,划痕距离逐渐降低,细胞迁移距离增加,侵袭能力增加。与对照组相比,高糖组和JQ1组细胞迁移距离和侵袭显著增加（P<0.01）,JQ1处理后,细胞迁移距离和侵袭能力比高糖组显著降低（P<0.01）。Western blotting结果发现高糖刺激后BV2小胶质细胞激活PI3K/AKT通路,p-PI3K,PI3K,p-AKT以及AKT蛋白表达水平升高,JQ1处理组可一定程度降低PI3K/AKT通路活化,上述蛋白表达水平相比高糖组呈降低趋势。各组细胞经PI3K通路激活剂740Y-P处理后直接导致PI3K通路活性剧烈升高,结果表明JQ1对BV2细胞的保护作用消失,PI3K/AKT通路各蛋白表达水平与高糖组差异不大。免疫荧光染色结果表明,高糖刺激组细胞PI3K磷酸化水平显著升高,相对荧光强度比对照组升高约3倍（P<0.01）,JQ1干预后,阳性细胞显著降低,与高糖组相比相对荧光强度显著降低（P<0.01）。结论:1.糖尿病视网膜病变大鼠玻璃体腔内注射JQ1可改善视网膜神经节细胞丢失和凋亡,具有保护视网膜神经节细胞的治疗效果,提示JQ1对糖尿病视网膜病变具有一定缓解作用。2 JQ1可以显著降低糖尿病视网膜病变大鼠视网膜内的炎性因子水平,可能是通过降低小胶质细胞迁移和侵袭能力、抑制小胶质细胞的激活来实现的。3.JQ1可下调糖尿病模型动物和细胞内PI3K/AKT信号转导通路基因的表达,降低高糖刺激引起的磷酸化PI3K表达的升高。提示将BET作为干预治疗靶点的治疗方法,具有治疗糖尿病视网膜病变的广阔前景。