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【研究背景和目的】信号转导与转录激活因子5(Signal Transducer and Activator Of Transcription 5,STAT5)在人体内有着广泛的生理病理功能。STAT5能被多种细胞因子(cytokines)如催乳激素(prolactin,Prl)、红细胞生长素(erythropoietin)、生长激素(growth hormone,GH)和上皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等激活并能反馈的调控多种细胞因子。在肝脏中,有研究发现GH-STAT5信号通路在控制脂代谢途径上发挥着重要的作用:肝脏特异性敲除STAT5后,增加了CD36和PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor)的表达,导致实验小鼠出现明显的脂肪肝、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗和肝脏再生能力受损。此外STAT5在肝脏的缺失,还会引起TGF-β和STAT3的表达增加,加速了肝脏的纤维化和肿瘤的形成。另外,肝特异性的敲除STAT5A后,调控了NOX4(reactive oxygen species(ROS)-generating enzyme NOX4)的表达,导致凋亡蛋白PUMA和BIM的表达下降,从而促进了肝癌细胞增殖。STAT5包含了STAT5A和STAT5B两个亚型,二个亚型均由人类17号染色体上衔接的连锁基因所编码,并在DNA结构上有95%的相似性,但是由于蛋白结构上的反式激活区域存在着一定的差异,STAT5A和STAT5B在生理病理过程中都有着特异的生物学功能。本课题旨在探究STAT5A亚型在肝癌进展中的作用,尤其是对肝癌糖代谢的影响。同时,希望能从抑制糖代谢的角度寻找新的潜在的治疗靶点。【研究方法】首先,利用病人组织芯片,分析并明确STAT5A在肝癌病人肿瘤组织中的表达情况。Kaplan-Meier方法分析STAT5A的表达与预后的关系以及进行多因素的生存分析。在生物学功能方面,首先构建STAT5A过表达的稳转Huh7肝癌细胞系,利用CCK8、流式分析及裸鼠皮下荷瘤实验探索STAT5A对于肝癌细胞增殖和细胞周期的影响。然后,利用Kit检测STAT5A的表达对于细胞葡萄糖消耗,乳酸代谢的影响。更进一步凭借GC-MS技术,具体的分析糖酵解和TCA循环上各代谢产物的变化。在机制方面,利用q-PCR技术和Wectern blot技术分析验证STAT5A可能的作用通路以及作用的糖代谢靶点。【研究结果】(一)STAT5A的表达与患者预后的关系1.根据148例病人的组织芯片结果分析发现,与配对癌旁组织相比,STAT5A在肝癌肿瘤组织中的表达明显降低。用Kaplan-Meier生存分析方法分析发现,肿瘤中STAT5A低表达组OS较高表达组明显降低。多因素生存分析也有类似的结果:STAT5A的表达与是否有包膜、AFP的表达和肿瘤大小可以作为影响RFS和OS的独立风险因素。(二)STAT5A在体内外对肝癌细胞增殖能力、细胞周期的影响1.检测STAT5A在常用肝癌细胞系中的表达,挑选Huh7构建了稳转的过表达细胞系,而敲除STAT5A的细胞系则用相对应的si RNA,并用WB对STAT5A的表达进行验证。2.CCK8增殖实验发现,过表达STAT5A后肝癌细胞的增殖明显被抑制,而敲除STAT5A之后细胞的增殖能力明显增强。裸鼠皮下荷瘤实验也证实了STAT5A能抑制肝癌细胞的增殖。流式技术分析还发现,STAT5A过表达可以抑制肝癌细胞的周期进展,使肝癌细胞更多的停滞在G0/G1期,减少了细胞的有丝分裂。3.关于糖代谢方面,首先利用相关kit检测培养基葡萄糖和乳酸,发现STAT5A过表达可以明显的减少肝癌细胞葡萄糖的消耗和乳酸的产生。进一步的针对具体代谢产物的分析提示,STAT5A过表达可以降低糖酵解和TCA循环上的主要产物。(三)STAT5A机制探究1.在通路方面,发现STAT5A可以明显的调控AKT的磷酸化,而反过来抑制AKT之后STAT5A的磷酸化也会增加。配对病人的组织芯片结果也证实,STAT5A的表达与p-AKT的表达呈负性相关。2.利用knock-down和过表达的细胞进行q PCR检测发现STAT5A在转录水平能影响多种基因的表达,在病人组织的RNA水平上也有类似的结果。进一步的WB实验发现,STAT5A会明显的影响HK2的蛋白水平的表达。加入AKT抑制剂之后能逆转HK1的蛋白表达证实,AKT通路在STAT5A-HK2的调控过程中有着重要的作用。3.发现了mi RNA-23a可以负调控STAT5A的表达。4.此外,我们还证实了,STAT5A对另一个重要的转录因子HNF4α有着明显的正调控,并且,HNF4α可以直接作用于PI3K。【研究结论】本课题首先明确了STAT5A在肝癌患者肿瘤组织中低表达,并且低表达组预后较差。接着在细胞学以及动物水平上验证了STAT5A能明显抑制细胞的增殖和细胞周期的进展,发挥着重要的抑癌作用。关于糖代谢方面,我们发现STAT5A的过表达可以明显的抑制糖酵解过程和TCA循环,从能量的角度抑制肿瘤的进展。在机制方面,我们验证了STAT5A与p-AKT的关系,并且确定了下游糖代谢的关键基因HK2。此外,还发现了可以调控STAT5A的mi RNA-23a以及STAT5A-HNF4α-PI3K-AKT信号通路,但具体的机制尚不清楚,仍需进一步研究。