对于完全缓解的白血病患者，体内存在的微小残留病（MRD）是复发的主要根源。经诱导化疗取得临床完全缓解后这意味着体内至少还存在着108个肿瘤细胞，在此肿瘤负荷下依赖机体自身的免疫能力是无法根除白血病肿瘤细胞，只有当肌体内白血病细胞总数低于106时（重量低于毫克），肌体才有可能依靠机体自身的免疫保护机制消除体内残存的白血病肿瘤细胞（即微小残留病），由于临床常用的实验检测方法如细胞形态学、染色体分析、免疫标记技术等仅能从100个正常细胞中检测出15个白血病肿瘤细胞，即其对骨髓白血病细胞的检出灵敏度也10-2，因此采用上述方法检测急性淋巴细胞白血病的微小残留病显然达不到临床需要，近20年来的细胞生物学研究已经显示，因此适合于急性白血病微小残留病检测的技术敏感性需至少达到10-4，即在10000个细胞正常细胞中可以检出1个白血病细胞，这就要求更为敏感的分子免疫学或分子生物学技术或两种技术的融合，用于急性白血病微小残留病的检测。提高残留白血病细胞检测技术的水平其重要意义在于:(1)指导白血病化疗,根据体内白血病细胞的负荷决定是继续治疗还是停止治疗;(2)在新的水平上选择最适宜的联合化疗药物;(3)更早地发现药物的耐药;(4)更早地预测白血病复发;(5)评价自身骨髓移植的净化效果；（6）为体内残留白血病细胞分布和增殖动力学的研究提供可能性。起源于单克隆增殖的恶性肿瘤,IgH和TCR基因从胚系状态向功能<WP=50>状态转化过程中所有细胞只有同一形式的基因重排,经PCR扩增后,电泳呈一窄带。而正常人淋巴细胞群,不同的细胞克隆及其分化阶段具有特异的基因重排类型,由多克隆组成,不同克隆来源的细胞V (D) J区碱基序列各异,故基因重排产物经PCR扩增后,电泳呈弥漫分布,没有明显的重排带，反应性淋巴细胞增多或增生性淋巴结炎和恶性组织细胞病均无克隆性IgH、TCRγ基因重排。根据这种重排方式的存在与否,可以区别正常与肿瘤细胞［11-16］，故IGH和TCR基因重排，可以作为检测ALL患者的MRD的一个重要依据。本文的主要工作如下：本实验是通过双链DNA结合SYBR Green I的实时PCR方法应用免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体(TCR)基因重排作为ALL微小残留病的检测靶基因，追踪检测10例临床已明确诊断的ALL病人。1.通过传统的PCR方法筛查了所追踪观察的10例病例中的IgH、TCRγ基因重排阳性病例。2.对阳性病例进行标准模板的构建：主要是将阳性样本的PCR产物进行纯化后与pMD-18 T载体的连接，连接后的质粒经过转化到感受态细胞后培养扩增，进行蓝白筛选后，选出已与pMD-18 T载体连接目的基因质粒DNA，将其提纯后，计算出它的标准拷贝数，用正常人的DNA分别稀释应用正常人的DNA(正常人一个细胞的DNA的量是6pg，为1个拷贝)逐渐稀释至如下标准的质粒拷贝数：10-1（即10个正常人细胞中有1个含有目的基因质粒）、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，用作荧光定量ＰＣＲ参比模板.3.优化实时PCR反应体系及条件，应用德国罗氏公司的LightCycler荧光定量PCR仪，应用软件3.3版。应用德国罗氏公司的LighCycler DNA Master SYBR Green I kit.用上述构建的标准参比模板，应用双链DNA结合SYBR Green I的实时PCR自动绘制线性标准曲线、熔点曲线。4.应用参比模板做标准进行样品的CR1、CR2、CR3各期的SYBR <WP=51>Green I的实时定量PCR进行MRD检测结果1.在10例患者中3例T细胞性ALL中表现重排的有2例，占67%，7例B细胞ALL的患者中有IgH重排的有6例，占86%，所有标本的总检出率80%。证明了IgH和TCR基因重排做为检测ALL MRD的标志具有检出率高、特异性强等特点。2.患者在第一次完全缓解中多数体内残存有较多的白血病细胞，白血病细胞检出率达10-2-10-3，随着化疗次数的不断增加，患者体内残存的恶性细胞不断减少，但在复发前都有一个残留病的升高经过如：9号和10号标本，这说明，MRD可以作为一个独立的预后风险指标。3．SYBR Green I的实时定量PCR克服了传统PCR的不能定量.假阳性高.操作繁琐的缺点。达到对各治疗阶段的骨髓或外周血中白血病细胞数的具体定量，利于对微小残留病的监测，从而指导临床治疗。 4．与荧光探针的实时定量PCR的方法比较SYBR Green I实时定量PCR 避免了设计、标记荧光探针和使用价格昂贵、复杂的试剂，检测费用降低，仅是Taqman探针荧光定量PCR价格的7 %～10 %,它适用于任何PCR 扩增体系。Sybr green 1实时定量PCR检测MRD的缺点可以通过熔点曲线和优化反应体系和严格设计引物的方法加以克服。在本实验中如果针对每个病人不同的IgH/TCR N-插入区设计出特异性寡核甘酸引物一条，再结合一条公共引物进行缓解期MRD的检测，则特异性会更强。Sybr green 1实时定量PCR是检测MRD简单、快速、便宜、可行，特异性好、敏感性又高的技术方法。