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卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一,其病死率位居妇科恶性肿瘤之首,严重威胁着妇女的健康和生命。在过去的三十年里,尽管在外科医疗技术和临床治疗方案等方面都取得了巨大的进步,卵巢癌仍然是最致命的妇科恶性肿瘤。卵巢癌发病比较隐匿,近70%患者在确诊时已是晚期或已有转移,导致治疗效果不理想。此外,目前癌症治疗的另一个主要的挑战是,卵巢癌细胞在临床、细胞和分子水平上具有独特的生物学特点即高度异质性。因此,了解不同卵巢癌细胞亚型的生物学行为及特性是有效治疗卵巢癌的关键。本课题研究内容分为以下两部分：第一部分：雌激素及其相关代谢物对卵巢癌细胞的作用机制的实验研究第二部分：抗坏血酸对卵巢癌细胞的影响及与雌激素及其相关代谢产物的相互作用第一部分雌激素及其相关代谢物在卵巢癌细胞的功能的实验研究研究背景：最近的流行病学研究已经证实卵巢癌发病率升高与绝经后使用雌激素密切相关,雌激素已被认为是导致卵巢癌发生的主要危险因素。可是,在卵巢癌中雌激素的确切作用仍然足有争议的。雌激素对卵巢癌细胞具有刺激作用还是抑制作用或是没有影响可能取决于卵巢癌细胞亚型的个体,使用雌激素的剂量,患者的年龄(例如,绝经前和绝经后)等。此外,众所周之,多数卵巢癌细胞表达雌激素受体1(ESR1,也被称为ERα)和雌激素受体2(ESR2,也被称为ERβ)。这些受体的表达可能对卵巢癌细胞具有不同的作用。订研究证明ERα的表达可以促进卵巢癌的进展,而ERβ的表达可以抑制ERa介导的对卵巢癌细胞的刺激作用。另一方面,最近也有研究表明,雌激素诱导卵巢癌细胞的生长可能与ER受体无关。雌激素在体内可以转化为多种具有生物活性的代谢产物。特别是,雌二醇-17β(E2β)可以由细胞色素P450家族的CYP1A1和CYP1B1催化,转化为2-羟基雌二醇(2OHE2)和4-羟基雌二醇(40HE2),随后可以由几茶酚氧位甲基转移酶(COMT)转化为2-甲氧雌二醇(2ME2)和4-甲氧雌二醇(4ME2)。这些雌激索代谢物在不同类型的卵巢癌细胞中可能具有不同的作用。事实上，生理浓度的2OHE2和4OHE2可以在体外刺激卵巢癌细胞OVCAR-3的增殖,而超生理浓度的2ME2可以抑制多种卵巢癌细胞的增值,包括OVCAR-3,A2780和其它一些原发性卵巢癌细胞。到目前为止，E2β及其代谢产物对卵巢细胞生长的影响及具体机制知之甚少。鉴于此,我们利用增殖和迁移实验探讨E2β及其代谢产物是否对卵巢癌细胞增殖、迁移等恶性生物学行为产生影响并确定该影响是否基于雌激素受体的表达。研究目的：1.检测(CYP1A1,CYP1B1,COMT基因与雌激素受体ERα和ERβ在人卵巢表面上皮细胞(IOSE-385)和卵巢癌细胞系(OVCAR-3.SKOV-3,OVCAR-429和OVCAR-432)中的表达；2.检测E2β及相馆代谢产物对人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞增值作用的影响并确定该影响是否基于雌激素受体的表达；3.检测E2β及相关代谢产物对人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞迁移作用的影响。研究方法：1.Western Blot分析法检测在人卵巢表面上皮细胞(IOSE-385)和卵巢癌细胞系(OVCAR-3,SKOV-3, OVCAR-429和OVCAR-432)中CYP1A1, CYP1B1, COMT与雌激素受体ERα和ERβ的表达情况；以GAPDH和β-actin作为内参。2.细胞生物学行为的检测：不同浓度的雌激素及其相关代谢物处理人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞六天,用结晶紫实验方法检测细胞生长增殖；选取雌激素受体拮抗剂ICI,ERa受体拮抗剂MPP和ERβ受体拮抗剂PHTPP分别抑制雌激素受体的表达,再用不同浓度的雌激素及其相关代谢物处理人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞六天,结晶紫实验方法进一步验证雌激素及其相关代谢物对细胞生长增殖能力的影响是否基于不同雌激素受体的表达。3.细胞划痕实验进一步验证不同浓度雌激素及其相关代谢物对人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞迁移的作用。结果：1.人卵巢表面上皮细胞(IOSE-385)和卵巢癌细胞系(OVCAR-3,SKOV-3, OVCAR-429和OVCAR-432)中均检测到有CYP1A1, CYP1B1, COMT, ERα和ERβ的表达。1) CYP1A1和CYP1B1在这些细胞中的表达水平相似；但在IOSE-385, OVCAR-3和OVCAR-432细胞中,CYP1B1的表达要高于CYP1A1;2) COMT在IOSE-385细胞中的表达水平比其他的细胞系至少高两倍：3)ERα和ERβ在OVCAR-432细胞中的表达高于其他的细胞系。2.E2β及其代谢产物刺激IOSE-385和OVCAR-3细胞增殖,而不影响SKOV-3, OVCAR-429斥和OVCAR-432的细胞增殖。1)不同浓度的E2β刺激IOSE-385和OVCAR-3细胞的增殖,在0.1nM浓度时处刺激作用最明显；2)不同浓度的2OHE2,4OHE2和4ME2促进IOSE-385细胞的增殖,而2ME2只在0.1nM浓度时产生作用;3)不同浓度的2ME2,4OHE2和4ME2促进OVCAR-3细胞增殖,而20HE2却只在0.1和100nM浓度时产生作用。雌激素受体拮抗剂ICI抑制E2β对IOSE-385和OVCAR-3细胞的增殖效应,但对其代谢产物没有作用。α受体拮抗剂MPP抑制E2β对OVCAR-3细胞的增殖效应；β受体拮抗剂PHTPP抑制E2β对IOSE-385细胞的增殖效应。MPP和PHTPP不影响E2β代谢产物对卵巢细胞的增殖作用。3.E2β及其相关代谢物对人卵巢表面L皮细胞和卵巢癌细胞迁移能力的影响不明显,与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05)。结论：1.E2β及其相关代谢物促进人卵巢表面上皮细胞和部分种类卵巢癌细胞的增殖而对其迁移能力无明显影响,提示可能选择性参与卵巢癌的发生发展；2.E2β及其相关代谢物对人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞的调节作用与其受体密切相关。第二部分抗坏血酸对卵巢癌细胞的影响及与雌激素及其相关代谢产物的相互作用研究背景：维生素C是人类及某些动物体内的一种必需的营养素和抗氧化剂,抗坏血酸(Ascorbic Acid; AA)是维生素C的简化形式,它是人体主要的化学结构。AA早已被认为在预防和治疗人类癌症中起重要作用。然而,到目前为止,对AA具体的抗癌机制知之甚少。仅知与AA的浓度及癌症种类有关,还没有确凿的临床结果证实其抗癌作用。例如,使用生理浓度的AA (<100μm)急性处理1或2小时,对许多癌细胞包括卵巢癌细胞的生长没有显着的影响。相反,药物浓度的AA可以特异性针对肿瘤细胞(不包括正常的细胞),杀死卵巢癌、乳腺癌及肺癌等癌细胞(EC50<10mM),可能通过提高癌组织中的过氧化氢的水平来抑制小鼠卵巢癌、胰腺癌及胶质母细胞瘤的发展。这些数据表明,AA的抗癌特性高度依赖于治疗浓度。因此,我们的实验扩展了这些报道,将生理及药理浓度的AA作用于卵巢细胞进行探讨。雌激素E2p和抗坏血酸AA对肿瘤生长的积极或消极作用已有报道。到目前为止,有关E2β代谢产物和AA之间的相互作用未见报道。鉴于此,本实验我们探讨E2β及其代谢产物是否和AA交互作用,共同调节卵巢癌细胞的增殖。研究目的：1.研究AA对人卵巢表面上皮细胞(IOSE-385)和卵巢癌细胞系(OVCAR-3,SKOV-3, OVCAR-429和OVCAR-432)增殖的影响；2.研究AA和E2p及其代谢物对人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞的共同作用。研究方法：1.不同浓度AA处理人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞四天,结晶紫实验方法检测细胞生长增殖；2.确定一个最佳剂量后,AA和E2p及其代谢物共同处理人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞四天,结晶紫实验方法检测细胞生长增殖能力。结果：1.AA可抑制人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞生长增殖,呈剂量依赖性：1)与对照相比,在IOSE-385, OVCAR-3, SKOV-3和OVCAR-432细胞中,AA处理4天后,所有剂量都可抑制(P<0.05)细胞增殖,估计的IC50分别为60,60,67,和122μM。2)AA可以促进OVCAR-429细胞的增殖(AA≤125μmol/L),然而,AA也可以抑制OVCAR-429细胞增殖(AA>125μmol/L)。2.确定最佳的剂量后,采用80μMAA和0.1nM E2β及其代谢物联合处理人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞4天。我们观察到E2β及其代谢物明显(P<0.05)衰减AA诱导的对IOSE-385, OVCAR-3,和OVCAR-432细胞的抑制作用,但对OVCAR-429细胞和SKOV-3细胞无作用。结论：1. AA可抑制人卵巢表面上皮细胞和卵巢癌细胞生长增殖能力,呈剂量依赖性,提示AA在卵巢癌的治疗中发挥重要作用；2. E2β及其相关代谢物对抗AA对卵巢癌细胞的抑制作用,阻断E2β及其相关代谢物的作用可能会大大提高AA的抗癌活性。