红球菌反-Prelog羰基还原酶重组表达及其催化合成手性醇研究

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手性醇因其独特的光学性质,在医药、功能环保材料、农药、香精香料领域扮演非常重要的角色。近年来,随着生物技术的逐步发展,生物酶催化制备手性醇已成为最有前景的方法之一。羰基还原酶作为氧化还原酶家族的一员,可以催化羰基化合物还原加氢生成相应手性醇。然而,当前许多生物催化剂存在的催化底物浓度低、立体选择性差的问题限制了其工业化生产。因此,除了对已有催化酶类的改造外,新型羰基还原酶的挖掘仍势在必行。本文以模型化合物苯基乙二醇 ((R)-PED)的合成为目标,筛选对其具有转化能力的细菌菌株。从筛选得到的菌株中挖掘羰基还原酶基因,构建了一株高效表达羰基还原酶基因的重组大肠杆菌。并对重组蛋白进行了分离纯化,研究其酶学性质。其次以羰基还原酶为催化剂,通过耦联辅酶再生循环系统,成功实现辅酶 NADH 的再生。最后对双酶催化转化的两相体系进行优化,建立了一种高效生产(R)-PED的酶法制备工艺,为生物酶法合成(R)-PED的工业应用奠定了基础。主要研究结果如下:  (1)以 α-羟基苯乙酮(2-HAP)为底物,从土壤中筛选得到一株高立体选择性还原2-HAP生成(R)-PED的细菌菌株HBU-SI7。经形态学观察和16S rDNA序列分析,鉴定此转化菌株为红球菌属菌Rhodococcussp.。该菌株对0.5 g/L 2-HAP的转化率可高达90.1%,且生成的(R)-PED的对映体过量值(e.e.)达到98.9%。  (2)从红球菌HBU-SI7的基因组中挖掘到新型的羰基还原酶基因rhadh。rhadh编码的羰基还原酶遵循反-prelog规则。将该基因与表达载体pGEX-4T-1相连并转化大肠杆菌细胞,得到重组菌株E. coli/pGEX-4T-1-rhadh。利用GSTrap HP亲和层析柱,分离纯化重组蛋白RhADH。经SDS-PAGE分析,RhADH分子量为36 kDa。酶的比活力为110 U/mg,纯化倍数为900倍,酶活收率为29.8%。对 RhADH 进行了酶学性质的研究,结果表明该酶热稳定性和酸碱稳定性良好,最适反应温度为45 ℃,最适反应pH为7.5。金属离子对酶活力影响较大,2 mmol/L Cu2+完全抑制了RhADH酶活性,而2 mmol/L Zu2+则对酶活力有明显促进作用。RhADH具有广泛的底物特异性,对多种含羰基的底物都有较好的催化效果和较高的立体选择性。  (3)从近平滑酵母C. parapsilosis中扩增得到甲酸脱氢酶基因片段cpfdh,并构建了重组大肠杆菌E. coli/pET28a-cpfdh。通过亲和柱层析分离纯化得到重组蛋白CpFDH后,与RhADH建立了双酶耦合系统,实现了辅酶NADH的原位再生。当 RhADH:CpFDH 酶活比为 1∶10 时,底物 2-HAP 的转化率最高,可达98.3%。  (4)对双酶耦合系统的催化体系进行了优化,结果显示在以磷酸缓冲盐为水相的体系中引入邻苯二甲酸二丁酯作为有机相,降低了底物和产物对催化反应的抑制,促进了催化转化的效率。该两相体系中,水和有机相最适体积比为3∶1,最适底物浓度为40 g/L,转化率达到99.0%,e.e.值在99%以上。该两相体系显著地提高了不对称还原反应的效率。
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