小麦茎基腐病是由多种病原菌引起的土传病害,在世界范围内对小麦的生产和粮食安全构成严重威胁。其致病菌主要有假禾谷镰刀菌、禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌等。尤其是假禾谷镰刀菌在近几年已上升为我国黄淮海小麦主产区的优势病原菌之一。目前对于假禾谷镰刀菌的研究主要停留在生物学形态和遗传多样性等方面,而对于其致病机理的研究报道比较少。热激蛋白Hsp70是真核生物中高度保守的多基因家族蛋白,广泛参与生物体的形态发育和逆境胁迫等生物学过程。但是其在假禾谷镰刀菌中的功能还未见报道。本研究以热激蛋白Hsp70家族中的FpLhs1基因作为切入点,分析其在假禾谷镰刀菌生长、产孢及侵染中的作用,为揭示假禾谷镰刀菌致病的分子机理提供理论基础。根据物种中已知的Hsp70蛋白,通过blast方法在假禾谷镰刀菌中鉴定出14个具有明显Hsp70结构域的蛋白,分别命名为FpHsp70-1～14。根据其蛋白定位分成5个亚家族,包括3个内质网定位、7个细胞质定位、2个内质网定位、1个细胞核定位和1个质体定位。分析FpHsp70s的基因结构发现,线粒体定位的FpHsp70s具有1-4个内含子,细胞质定位的FpHsp70s具有1-8个内含子,其它定位的FpHsp70s无明显规律。分析FpHsp70的蛋白基序组成发现,不同于植物的Hsp70蛋白,不同亚家族的FpHsp70的蛋白基序无明显规律。为了分析FpHsp70在假禾谷镰刀菌侵染中可能的功能,通过转录组数据分析显示,虽然FpHsp70在假禾谷镰刀菌菌丝阶段的表达量差异较大,但是除了FpHsp 70-3和FpHsp 70-6,其它所有FpHsp70均在侵染阶段诱导表达,其中FpHsp70-12在菌丝和侵染阶段的表达均最高,而FpHsp 70-4在侵染阶段诱导表达的倍数最高,达1383至5196倍。两个内质网定位的Hsp70蛋白FpLhs1和FpKar1在侵染阶段诱导表达2至5倍。表达分析结果显示,绝大部分FpHsp70可能参与假禾谷镰刀菌的致病过程。已有研究表明,分泌蛋白在植物病原真菌致病过程中非常重要,而内质网是蛋白分泌关键的场所,所以我们选择了两个内质网定位的FpHsp70蛋白做进一步的功能分析。通过split-marker的方法构建含有潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的靶标基因敲除盒,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化方法分别对FpLhs1和FpKar2进行基因敲除,通过潮霉素抗性筛选、PCR检测及基因组重测序方法,成功筛选到2个FpLhs1基因缺失的突变体,△fplhs1-3和△fplhs1-10。随后将FpLhs1基因及其启动子序列构建回补载体pKNTG,转化△fplhs1突变体菌株,通过G418抗生素筛选、PCR检测及荧光观察,获得其基因回补菌株。为了获得FpKar2基因缺失的突变体,筛选了 50多了具有潮霉素抗性的单菌落,但均未获得FpKar2基因缺失的菌株。通过FpLhs1蛋白定位观察结果显示,与预测的结果相一致,FpLhs1定位在内质网上。通过分析△fplhs1突变体的生物学表型,结果显示,与野生型和回补突变体菌株相比,△fplhs1突变体菌丝生长速度有所降低,但其菌落和菌丝形态无明显变化;分生孢子的产量明显降低,△fplhs1突变体产生的分生孢子明显短小、两端变圆、内隔膜数量减少,分生孢子萌发速率明显降低;通过小麦下胚轴、大麦叶片和盆栽接种,结果显示,与野生型和回补菌株相比,△fplhs1突变体的致病力明显降低,侵染和扩展能力明显受阻。为了分析热激蛋白FpLhs1在假禾谷镰刀菌致病过程中可能的作用机理,分析了△fplhs1突变体在刚果红、硫酸铜、过氧化氢、SDS和氯化锰中的耐受性,结果显示,与野生型和回补突变体相比,△fplhs1突变体的生长无明显变化。对野生型菌株和△fplhs1突变体的分泌蛋白组进行测序,结果显示,60个蛋白在△fplhs1突变体分泌蛋白组中明显减少,而选取其中的6个进行实时荧光定量PCR分析发现,与野生型相比,其在△fplhs1突变体中的表达无明显变化,说明FpLhs1的缺失影响了一些蛋白的分泌。综上所述,内质网定位的热激蛋白FpLhs1参与了假禾谷镰刀菌的生长、产孢和致病过程,并影响病原菌蛋白的分泌。该结果将为解析假禾谷镰刀菌致病的分子机理提供理论基础。