论文部分内容阅读
心肌缺血后适应是近年来发现的重要的心肌内源性保护现象,可明显减轻缺血-再灌注所致的心律失常,改善心肌功能,减少心肌梗死面积。但对其心肌保护机制目前尚不完全清楚。深入探讨缺血后适应的心肌保护机制将为心肌损伤的防治研究提供新的思路。Mipu1是本室从缺血预适应大鼠心肌中分离的新基因。本室前期研究发现Mipu1在缺血-再灌注及缺血预适应心肌中表达增加,且对氧化应激所致的心肌细胞损伤具有保护作用。但Mipu1在心肌缺血后适应中的表达发生何种变化,其表达调控机制是什么,是否具有心肌保护作用等目前尚不清楚。本课题是在本实验室前期工作的基础上,采用大鼠心肌缺血后适应动物模型、心肌细胞H9c2过氧化氢损伤及缺氧后适应的细胞模型,探讨Mipu1在心肌缺血后适应心肌中的表达模式,并探讨转录因子CREB在心肌缺血后适应中对Mipu1表达的调控作用及其心肌保护作用和机制。主要方法与结果如下：1.采用在体大鼠,结扎左冠状动脉前降支45min,再灌注9h制备心肌缺血-再灌注损伤模型,并在再灌注9h前行再灌注30s缺血30s(重复三次),制备心肌缺血后适应模型；检测血清酶学指标、心肌梗死面积和Caspase-3活性以评价心肌受损情况；采用生物信息学技术分析Mipu1基因启动子区的转录因子结合位点；采用Real-time PCR和Western-blot检测心肌中CREB和Mipu1的表达。结果显示：(1).缺血后适应可明显减轻缺血-再灌注所致的心肌损伤,表现为血清酶学指标下降,心肌梗死面积减少,心肌Caspase-3活性明显降低；(2).缺血-再灌注损伤导致心肌中Mipu1的mRNA和蛋白水平以及磷酸化CREB蛋白水平的上调,缺血后适应可进一步上调大鼠心肌中Mipu1和磷酸化CREB的表达；(3).生物信息学分析发现,Mipu1基因启动子区含有CREB、HSF1和Elkl等多个转录因子的结合元件。2.采用荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀技术发现心肌细胞缺氧后适应通过激活cAMP/PKA信号通路而导致CREB的磷酸化和活化,活化的CREB与Mipu1启动子区的第二个CREB结合元件(CREⅡ)相结合,增加Mipu1启动子活性从而上调Mipu1的表达；进一步采用RNA干扰和基因转染技术改变CREB的表达水平,探讨了缺氧后适应时CREB对Mipu1表达的调控作用。结果显示,抑制CREB表达可明显抑制缺氧后适应所致的Mipu1的表达上调；而过表达CREB可增强缺氧后适应所致的Mipu1的表达上调。3.大鼠H9c2心肌细胞经过氧化氢或缺氧后适应处理,采用基因转染及RNA干扰技术同时改变CREB和Mipu1的表达水平,采用MTT法、LDH活性分析、Caspase-3活性检测及凋亡百分率检测细胞受损情况,以探讨CREB所调控的Mipu1表达在氧化应激及缺氧后适应时对心肌细胞的保护作用。结果显示：(1).过表达CREB可以抑制由H2O2所引起的细胞死亡和凋亡,并下调LDH和Caspase-3活性,但在过表达CREB的同时采用RNA干扰技术抑制Mipu1的表达,则上述心肌细胞的保护作用被部分取消。与此相反,采用RNA干扰技术抑制CREB表达能进一步促进由H202所引起的心肌细胞死亡和凋亡,以及上调LDH和Caspase-3活性,但在抑制CREB表达的同时上调Mipu1表达则可减轻H202所致的心肌细胞损伤。(2).缺氧后适应可减轻缺氧-复氧所致的心肌细胞损伤,表现为细胞存活率增加,LDH释放减少,细胞凋亡减少及Caspase-3活性降低。过表达CREB可增强缺氧后适应的上述保护作用,但此作用可被Mipu1的RNA干扰所减弱。与此相反,抑制CREB表达则可抑制缺氧后适应的心肌细胞保护作用,但在此基础上过表达Mipu1则可部分恢复缺氧后适应的心肌保护作用。综上所述,大鼠心肌缺血后适应可通过激活cAMP/PKA信号通路而促进转录因子CREB的表达和活化；CREB可直接与Mipu1启动子区的CREⅡ相结合,上调Mipu1表达,从而发挥心肌保护作用。