论文部分内容阅读
半枝莲(Scutellaria barbata D.Don),是我国少数民族的常用中草药材,主要化学成分为黄酮类、二萜类和生物碱等,具有突出的抗菌、消炎、抗病毒及抗肿瘤等功能,现在多单用或者与其他药组成复方,常被用于治疗肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病。目前国内外对于半枝莲的药理作用研究多集中于抗癌、保肝等作用机制的研究,而对于用传统的植物化学研究方法,利用药理模型对半枝莲进行抗乙型肝炎病毒生物活性研究,追踪药材有效部位并研究抗乙型肝炎机制的研究较少。本论文对半枝莲体外抗乙肝病毒活性进行了较为系统性的研究。实验研究内容包括以下三个方面。1.半枝莲总黄酮的提取与分离及含量测定。根据预实验初选结果,醇提液的抗乙肝病毒效果较好,进一步根据水提醇沉法精制半枝莲总黄酮,去除有机酸等杂质。通过分光光度法测定半枝莲醇提液中总黄酮含量为(54.24±3.74)%,醇提液经精制后总黄酮含量为(85.23±2.90)%。根据总黄酮中黄酮各个单体极性的差异,分别用不同体积分数的乙醇-水溶液经过大孔树脂洗脱,获得分别为0%、20%、40%、60%、80%不同乙醇体积分数的洗脱液。2.高效液相同时测定半枝莲的9种黄酮单体分析方法的建立。高效液相色谱同时测定野黄苓苷(scutellarin)、黄苓苷(baicalin)、野黄苓素(scutellarein)、檞皮素(quercetin dihydrate)、木犀草素(luteolin)、柚皮素(naringenin)、芽菜素(apigenin)、黄苓素(baicalein)、汉黄苓素(wogonin)9种黄酮单体的色谱条件为:WondasilC18色谱柱(250×4.6mm,5μm),流动相A液1%的醋酸,B液为色谱甲醇和乙腈配比(80:20),梯度洗脱,流速0.8mL/min;柱温25°C,检测波长340nm,色谱分离梯度条件(min、B%):0-20 min,38%;20-30 min,38%-44%;30-40 min,44%-52%;40-50min,52%-62%;50-55min,62%-80%;55-60min,80%-38%。在此条件下能够较好的将半枝莲总黄酮中的9种单体分离开来,精密度、重现性比较好,快速简单,可用于多种半枝莲黄酮成分含量的测定。并测定不同体积分数的乙醇经大孔树脂洗脱半枝莲醇提液的各个不同洗脱部位中9种黄酮单体的含量结果显示,不同体积分数乙醇洗脱后的洗脱液中的单体含量有差异,20%洗脱部位主要含有野黄芩苷,40%洗脱部位主要含有黄芩苷和野黄芩素,60%洗脱部位主要含有芹菜素,80%洗脱部位主要含有柚皮素等,半枝莲黄酮主要集中在20%、40%、60%乙醇洗脱部位。3.半枝莲黄酮体外抗乙肝病毒活性部位的筛选。构建以乙肝病毒感染的HepG2.2.15细胞作为体外抗乙肝病毒实验的模型,实验以半枝莲的水煎液、醇提液、经大孔树脂以不同体积分数的乙醇洗脱的各个部位、9种半枝莲黄酮单体为供试药物,实验方法为以MTT法观察供试药物对细胞的毒性作用;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定HepG2.2.15细胞分泌到上清液中的乙型肝炎HBsAg、HBeAg的抗原含量。以治疗指数TI来判定各个部位及成分抗乙肝病毒的效果。结果显示,半枝莲醇提液对HBsAg、HBeAg抗原的TI值分别为2.53和4.39;40%与60%洗脱部位效果较好,对HBsAg、HBeAg抗原的TI值分别为3.43和5.87,以及2.46和4.67;黄芩素单体对HBsAg、HBeAg抗原的TI值分别为6.65和3.36。结果表明半枝莲总黄酮具有一定的抗乙肝病毒作用,9种单体中野黄芩苷、黄芩苷、檞皮素、黄芩素以及汉黄芩素具有显著的抗HBV作用。