【摘 要】
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细菌性穿孔病是李生产上重要的细菌性病害,在我国李主产区普遍发生,目前还没有登记用于李树上防治该病的药剂。为有效防控该病害,本论文调查了贵州李主产区不同品种细菌性穿孔病发生情况,并采集样品分离鉴定了该病病原,同时针对致病菌建立了环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,开展了杀菌剂对其毒力测定及四霉素抑菌机理初探,并将建立的LAMP
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细菌性穿孔病是李生产上重要的细菌性病害,在我国李主产区普遍发生,目前还没有登记用于李树上防治该病的药剂。为有效防控该病害,本论文调查了贵州李主产区不同品种细菌性穿孔病发生情况,并采集样品分离鉴定了该病病原,同时针对致病菌建立了环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,开展了杀菌剂对其毒力测定及四霉素抑菌机理初探,并将建立的LAMP技术应用于由成团泛菌（Pantoea agglomerans）引起李细菌性穿孔病的田间防治,以期为李细菌性穿孔病早期诊断及精准防控提供参考。主要研究结果如下:（1）掌握了贵州李主产区细菌性穿孔病发病情况,明确其致病菌为Pantoea agglomerans。2020～2021年在贵州李主产区调查发现,李细菌性穿孔病在修文县、遵义市平正乡及松桃县等园区脆红李和酥李品种上发生较为严重,于每年4月中下旬或5月初开始发生。对采集的545个病叶和病枝条样品进行分离、纯化、回接后得到HXFJ、HSFJ、HSFJ-1、KY、KYY、LY和XWFJ 7株代表菌株。通过形态学观察、生理生化特征,并结合分子生物学分析,明确了引起李细菌性穿孔病致病菌为P.agglomerans。该病原菌培养20 h后进入生长缓慢期,36 h后进入衰亡期。温度为30℃、pH为7时利于该病原菌生长。（2）基于LAMP技术建立了P.agglomerans快速检测体系。以成团泛菌gyr B基因序列设计了3对引物,并对LAMP初始反应体系和条件进行了优化,在65℃下反应60 min扩增效果最佳。通过特异性检测证实了LAMP引物组仅对P.agglomerans呈现阳性,灵敏度验证LAMP体系最低检测限为5 fg/μL,比常规PCR高1000倍。建立的LAMP检测体系可从室内接种样品及田间样品中快速准确地检测到P.agglomerans。（3）明确了不同杀菌剂对P.agglomerans的毒力,并初步探索了四霉素对P.agglomerans的作用机理。10种杀菌剂中0.3%四霉素水剂（AS）对P.agglomerans毒力最强,EC50为1.7056μg/mL;其次为2%春雷·四霉素可溶性液剂（SL）,EC50为75.5011μg/mL。设置EC50和EC75两种浓度处理,初步开展了四霉素作用机理初探。该药剂对P.agglomerans保护作用强于治疗作用。四霉素作用菌体后,EC75处理P.agglomerans培养液的电导率随作用时间延长,电解质外泄越严重,且P.agglomerans胞内DNA和蛋白质等大分子物质也发生外泄,说明P.agglomerans细胞膜通透性发生改变;同时四霉素EC50和EC75处理对P.agglomerans生物膜形成及胞外多糖的产生也具有明显抑制作用,其中EC75处理对生物膜形成的抑制率达51.26%。四霉素处理后,P.agglomerans菌体丙酮酸含量升高,苹果酸脱氢酶活性降低,ATP含量下降。可见,四霉素可抑制生物膜形成,破坏细胞膜稳定性,引起能量代谢紊乱,从而抑制P.agglomerans生长。（4）结合LAMP检测提前防控,应用0.3%四霉素AS可有效防控李细菌性穿孔病。在检测出阳性时开展田间防控,与未检测防控组（出现病害症状后开始防控）相比,相对防效明显提高。其中0.3%四霉素AS施药2次后7 d LAMP检测防控组的病情指数比未检测防控组低36.36%。说明应用LAMP检测开展细菌性穿孔病早期诊断是可行的,有利于精准防控。同时0.3%四霉素AS处理对细菌性穿孔病的防效最好,在LAMP检测防控组中施药2次后7 d、14 d的防效分别达78.23%和72.5%。0.3%四霉素AS处理还可提高李果单果重、维生素C和可溶性糖含量。
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