研究背景：霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)是一种淋巴造血系统的恶性肿瘤,其中经典型霍奇金淋巴瘤(classic Hodgkin lymphoma, cHL)约占霍奇金淋巴瘤病例的95%。该疾病为单克隆性淋巴细胞肿瘤,病变的典型形态特点是由少数的单核的霍奇金(Hodgkin)细胞和多核的Reed-Sternberg(RS)细胞组成H／RS细胞,背景中有数量不等的非肿瘤性背景细胞。约98%以上的H／RS细胞起源于生发中心阶段分化的成熟B细胞,极少数起源于外周T细胞。本课题组在探究CD99+／mCD99L2-调控B淋巴瘤细胞与H／RS细胞转化靶蛋白及信号通路的研究中,前期构建稳定过表达CD99基因的cHL(B细胞来源)L428细胞株…L428-CD99细胞亚系和稳定敲低CD99基因的鼠B细胞来源淋巴瘤A20细胞株…LV-mCD99L2-A20亚系,将L428、L428-CD99细胞及A20、LV-mCD99L2-A20细胞分别进行双向凝胶电泳实验,经生物信息学分析比对,从差异蛋白中挑选出stathmin蛋白作为研究对象。stathmin蛋白是一种广泛存在于细胞质中高度保守的磷酸化蛋白,属于微管调节相关蛋白,能通过调节微管解聚,参与微管的组装,调节微管动态平衡；还能与多种蛋白相结合,参与细胞周期、增殖、运动等许多细胞内生物进程；与肿瘤的发生关系密切,在多种恶性肿瘤中高表达。值得注意的是,近年来研究发现stathmin在细胞分化过程中起了十分重要的作用。有文献表明,在正常淋巴造血系统中,stathmin参与T淋巴细胞在胸腺组织的成熟过程；stathmin表达的下降促使巨核细胞分化成熟及血小板的形成。在淋巴造血系统肿瘤中,Stathmin蛋白表达对于维持和转变白血病细胞表达至关重要。然而,stathmin是否参与B细胞分化过程,在B细胞分化过程中呈现怎样的趋势,未见报道。为此,本研究采用免疫组织和细胞化学、实时荧光定量RT-PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜检测等方法,观测stathmin在病理组织和淋巴瘤细胞中的表达与定位；干扰stathmin基因后检测浆细胞相关转录因子PRDM1的表达、浆细胞免疫表型的表达及细胞生物学行为的改变,明确stathmin是否参与H／RS细胞向末端B细胞方向分化；调控与cHL最密切相关的NF-kappaB通路,探究NF-kappaB通路、stathmin、PRDM1的调控关系及诱导分化可能性,为进一步阐述H／RS细胞的发生和发展、转化与分化机制提供参考依据。研究目的本研究拟通过四部分进行：一、Stathmin在B淋巴瘤组织和细胞株的表达收集不同分化阶段的B细胞淋巴瘤组织和细胞株,检测stathmin的表达,探究stathmin在B细胞分化阶段的表达规律。二、Stathmin在cHL细胞株L428和L428-CD99细胞表达与定位检测cHL细胞株L428及L428-CD99亚系stathmin的表达及细胞内定位。三、调节stathmin促进H／RS细胞向末端B细胞方向分化探究stathmin与B细胞分化的关系,明确L428和L428-CD99细胞下调stathmin基因对浆细胞分化调控因了PRDM1的调控关系、分化相关抗原的改变和对细胞生物学行为的影响,揭示stathmin基因在cHL分化所扮演的角色。四、NF-KB信号通路调控stathmin影响H／RS细胞向末端B细胞方向分化通过激活和抑制NF-κB信号通路,探究stathmin是否通过NF-KB信号通路参与H／RS细胞向末端B细胞方向分化。研究内容与方法一、Stathmin在B淋巴瘤组织和细胞株的表达收集反应性淋巴结增生(reactive lymphoid hyperplasia, RH)、cHL、生发中心样(germinal center B cell-like, GCB)和活化B细胞样(activated B cell-like,ABC)型弥漫大B淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)、浆细胞性骨髓瘤(plasma cell myeloma, PCM)组织标本,通过免疫组化检测组织中stathmin表达；进一步利用Western blot检测不同分化阶段B淋巴瘤细胞株stathmin的表达。二、Stathmin在cHL细胞株L428和L428-CD99细胞表达与定位利用western blot、免疫荧光共聚焦显微镜检测L428及L428-CD99细胞中stathmin与acetylation α-tubulin的表达和共定位；利用免疫荧光共聚焦显微镜、实时荧光定量RT-PCR、western blot、免疫细胞化学检测L428及L428-CD99细胞中stathmin和PRDM1的表达。三、调节stathmin促进H／RS细胞向末端B细胞方向分化1.L428和L428-CD99细胞瞬时干扰stathmin基因对B细胞分化的影响L428和L428-CD99细胞瞬时转染stathmin小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),利用实时荧光定量RT-PCR、 Western blot检测stathmin的干扰效率及PRDM1表达差异；利用流式细胞仪检测L428细胞瞬时转染干扰stathmin基因后相关分化抗原表达。2.L428细胞瞬时干扰stathmin基因对生物学特性的影响利用CCK8实验、流式细胞仪检测,探究干扰stathmin基因对L428细胞增殖能力、凋亡和周期的影响。四、NF-κB信号通路调控stathmin影响H／RS细胞向末端B细胞方向分化1.调控NF-κB信号通路对B细胞分化的影响通过对L428细胞添加NF-κB信号通路抑制剂和L428-CD99细胞添加激活剂,利用实时荧光定量RT-PCR、Western blot检测Istathmin及PRDM1表达;利用流式细胞仪检测抑制NF-κB信号通路活性后L428细胞相关分化抗原的表达。2.抑制NF-κB信号通路活性对L428细胞生物学特性的影响利用CCK8实验、流式细胞仪检测,探究抑制NF-κB信号通路活性对L428细胞增殖能力、细胞凋亡和周期的影响。结果一、Stathmin在B淋巴瘤组织和细胞株的表达1. stathmin在RH病例中主要表达部位在生发中心(germinal centre, GC),且呈强阳性,而套区基本为阴性,滤泡间区散在阳性表达；在cHL中H／RS细胞强阳性表达,周围背景细胞散在强弱不等阳性表达。stathmin阳性表达强度在GCB-DLBCL中强于ABC-DLBCL,且呈相对弥漫阳性表达；PCM略强于ABC-DLBCL,且呈现相对散在阳性表达。2. stathmin在L428和OCI-Ly8、RPMI-8226和KM3中高表达,在RPMI-8226和KM3表达强于L428和OCI-Ly8,在OCI-Ly10中相对低表达。二、Stathmin在cHL细胞株L428和L428-CD99细胞表达与定位1.实时荧光定量RT-PCR、Western blot检测显示,与裸细胞组和空载体组比较,L428-CD99细胞亚系CD99基因和蛋白表达均增高(F=33.311,P=0.013)。2. western blot和免疫荧光共聚焦显微镜检测结果显示过表达CD99基因L428细胞stathmin和acetylation α-tubulin表达显著增强；免疫荧光共聚焦显微镜检测结果显示L428、L428-CD99细胞stathmin与α-tubulin acetylation α-tubulin表达部位完全重合；stathmin蛋白定位于细胞胞膜和胞浆,其中L428细胞stathmin蛋白表达主要定位于胞膜的丝足及丝状肌动蛋白区域；L428-CD99细胞stathmin蛋白在胞浆中的表达比例相比较L428增高,而在胞膜中的表达比例相比较L428降低。stathmin参与L428-CD99细胞骨架重构。3.实时荧光定量RT-PCR、western blot、免疫细胞化学检测结果显示L428细胞stathmin和PRDM1表达相对较弱,L428-CD99细胞stathmin和PRDM1表达明显增强(F=23.834,P=0.020)(F=205.232,P<0.001)。三、调节stathmin促进H／RS细胞向末端B细胞方向分化1.L428细胞瞬时转染siRNA干扰stathmin基因,实时荧光定量RT-PCR检测干扰组stathmin基因mRNA水平降低(F=47.155,P<0.001)；western blot检测干扰组stathmin表达减弱,PRDM1表达增强。L428-CD99细胞瞬时转染siRNA干扰stathmin基因,荧光定量RT-PCR检测干扰组stathmin基因mRNA水平降低(F=47.770,P<0.001)；Western blot检测lstathmin表达减弱,PRDM1表达减弱。2.L428细胞干扰stathmin基因,流式细胞仪检测干扰组细胞cHL诊断标记(CD15)表达降低,浆细胞标记(CD38、CD138)表达明显增强。3.L428细胞干扰stathmin基因后,CCK8实验检测干扰stathmin对L428细胞增殖起抑制作用(F=122.349,P<0.001；F=1106.644,P<0.001；F=25.100,P<0.001)。采用流式细胞仪检测干扰组细胞凋亡率相对增加,细胞周期停滞在G2／M期。四、NF-KB信号通路调控stathmin影响H／RS细胞向末端B细胞方向分化1.L428细胞添加NF-κB信号通路抑制剂,实时荧光定量RT-PCR检测干扰组stathmin基因1nRNA水平降低(t=30.280,P<0.001)；Western blot结果显示stathmin表达减弱,PRDM1表达增强。L428-CD99细胞添加NF-κB信号通路激活剂,实时荧光定量RT-PCR检测干扰组stathmin基因mRNA水平增高(t=-18.082,P<0.001)；Western blot结果显示stathmin表达增强,PRDM1表达减弱,CD99表达无明显差异。2.抑制NF-κB信号通路活性,流式细胞仪检测处理组细胞cHL诊断标记(CD15)表达降低,浆细胞标记(CD38、CD138)表达明显增强。3.抑制NF-κB信号通路活性,CCK8实验检测处理组L428-BAY细胞增殖能力减弱((F=297.382,P<0.001；F=968.735,P<0.001；F=71.293,P<0.001)。采用流式细胞仪检测处理组细胞凋亡率增加,细胞周期停滞在G1／S期。结论1. stathmin由生发中心向生发中心后分化阶段表达减弱;由生发中心后向浆细胞分化阶段表达明显增强,提示stathmin可能与B细胞分化有关。2. stathmin参与H／RS细胞向B细胞分化过程中细胞骨架的重构。3. stathmin负性调控L428细胞PRDM1表达,正性调控L428-CD99细胞PRDM1表达。4.NF-κB信号通路活性正性调控stathmin表达,负性调控PRDM1表达。5.干扰stathmin基因／抑制NF-κB信号通路活性促使H/RS细胞CD15表达降低,浆细胞标记CD38、CD138表达增强,出现由H/RS细胞向末端B细胞分化趋势,细胞增殖能力减弱,凋亡率增加。干扰stathmin基因,细胞周期停滞在G2/M期,抑制NF-KB信号通路活性,细胞周期停滞在G1/S期。创新之处1.初步揭示stathmin蛋白在成熟B细胞向浆细胞分化过程中的表达规律。2.初步揭示cHL可能通过调节NF-κB信号通路调控的stathmin和PRDM1表达,诱导H/RS细胞向末端B细胞方向分化,为阐述H/RS细胞的发展机制提供参考依据。