慢性粒细胞白血病多药耐药细胞lncRNA转录组学分析及其功能研究

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研究背景:慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)目前难以攻克的问题是耐药。尽管酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的使用取得了显着的临床疗效,但仍有很多患者出现不明原因的耐药现象。多药耐药(multidrug resistance,MDR)在白血病化疗中仍然是一项艰巨的挑战,并且是治疗白血病的一道障碍。ATP结合盒亚科B成员1(ATP-binding cassette subfamily B member 1,ABCB1)是引起MDR的公认因子,并且与肿瘤的不良结果和复发密切相关。为了探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和mRNA在K562/ADR细胞中的表达情况,我们对阿霉素耐药的CML细胞K562/ADR和其配对的敏感细胞K562进行lncRNA和mRNA测序。本项研究为揭示白血病细胞内lncRNA分子介导ABCB1异常高表达的分子机制,为逆转白血病细胞的多药耐药,改善患者预后提供有价值的实验数据。研究目的:筛选和鉴定K562/ADR细胞与K562细胞中差异表达的lncRNAs和mRNAs,生物信息学分析其发生多药耐药可能的分子调控机制;探究LINC02432在K562/ADR细胞中通过介导ABCB1过表达而导致多药耐药发生的分子机制,从而为逆转CML细胞多药耐药并增强其对药物敏感性提供实验依据。研究方法:通过对CML的K562/ADR和K562细胞进行lncRNA和mRNA测序,筛选差异表达的lncRNAs和mRNAs;通过GO和KEGG通路富集分析鉴定编码转录本的功能;通过lncRNAs与mRNAs的表达量相关性分析方法来预测lncRNA的靶基因;利用Cytoscape.exe构建了差异表达lncRNAs和mRNAs的共表达网络;通过qRT-PCR鉴定候选差异表达的lncRNA在K562/ADR和K562细胞中的基因表达水平;运用siRNA和lncRNA smart silencer技术靶向抑制LINCO2432,通过CCK-8检测细胞生长增殖能力,初步探究LINC02432增强K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性的分子机制。研究结果:共检测到差异表达的lncRNAs有176个,mRNAs有1801个。其中上调、下调的lncRNAs分别有91个、85个。上调、下调的mRNAs分别有751个、1050个;GO分析结果表明,差异表达的mRNAs分别富集在BP(生物学过程)、CC(细胞成分)、MF(分子功能)。BP前三个排名是“cellular metabolic process”、“metabolic process”和“organic substance metabolic process”。CC前三个排名是“intracellular part”、“intracellular”和“intracellular organelle”。MF前三个排名是“binding”、“protein binding”和“molecular function”。KEGG富集分析结果表明,差异表达的mRNAs主要富集在与癌症相关的通路和信号转导通路上。例如“VEGF signaling pathway”(富集13个差异基因)、“Chronic myeloid leukemia”(富集15个差异基因)、“Renal cell carcinoma”(富集14个差异基因)、“Melanoma”(富集15个差异基因)、“Acute myeloid leukemia”(富集13个差异基因)、“Bladder cancer”(富集10个差异基因)、“Non-small cell lung cancer”(富集13个差异基因)、“Viral carcinogenesis”(富集37个差异基因)和“Glioma”(富集16个差异基因)。通过构建lncRNA和mRNA的共表达网络,LINC01419、CCDC26、LINC02432和LINC01515与ABCB1可能有相互作用关系。LINC01515、CCDC26、LINC01419、LINC02432、DUXAP8、LINC00857和ZEB1-AS1在K562/ADR中高表达,通过使用siRNA对LINC01419、CCDC26、LINC02432、LINC01515进行敲低,只有抑制LINC02432能增加K562/ADR对阿霉素的敏感性并且下调多药耐药基因ABCB1的表达。结论:建立了阿霉素耐药细胞K562/ADR和敏感细胞K562lncRNA表达谱。鉴定了LINC01515、CCDC26、LINC01419、LINC02432、DUXAP8、LINC00857和ZEB1-AS1在K562/ADR中表达上调,可能与K562/ADR耐药发生机制相关。抑制LINC02432的表达能增加K562/ADR对阿霉素的敏感性,其增强药物作用的机制可能与降低ABCB1的表达及调控VEGF信号通路相关。
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