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背景人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)即人类疱疹病毒5型,是目前疱疹病毒科β亚科最常见的病毒之一,在自然界中普遍存在,人类是其唯一宿主,也是迄今为止已知的可致妊娠期女性活动性感染、胚胎及胎儿宫内感染的最常见病原体之一[1]。孕妇感染HCMV后,可传播给胎儿,引起胚胎或胎儿宫内感染,但目前HCMV导致胎儿发育异常的具体机制和途径尚不清楚,胎盘垂直传播或者是生殖道逆行传播被认为是其最有可能的传播途径,最近,胎盘感染成为研究热点,被认为是其主要的传播途径。孕妇在孕早期感染HCMV后可出现流产、早产、死胎及胎儿宫内生长受限等不良妊娠结局,即使胎儿勉强度过了孕期,出生后也面临巨大的威胁,表现为小头畸形、脑水肿、肝炎、肺炎、神经系统发育异常、听力障碍、智力发育迟缓等近远期不良结局[2]。迄今为止普遍认为,HCMV感染胎盘滋养层细胞是启动宫内感染的第一步,也是最关键的一步,绒毛外细胞滋养细胞(extravillous cytotrophoblast,EVT)增殖、分化及侵袭能力下降,导致螺旋动脉重铸不良、胎盘缺血缺氧、物质交换功能低下,是流产、胎儿宫内生长受限、胎儿畸形、胎死宫内等异常妊娠结局的重要病理生理机制。TGF-β/smad信号通路中的TGF-β1能使子宫内膜蜕膜化、调控滋养细胞的增殖、浸润及调节胎盘的结构形成及功能发挥,而smad4是唯一的共用介导型smad,能与磷酸化的受体smads结合后形成异源复合物,继而将细胞外信号传递至细胞内,作用于靶细胞发挥其生物学功能。故smad4在整个TGF-β/smad信号通路影响EVT功能中起到枢纽的作用。目的:通过HCMV体外感染EVT检测smad4基因表达水平,定向上调、下调smad4基因检测TGFβ/smad信号通路中相关基因的表达水平,初步探讨HCMV经TGFβ/smad生物信号通路对EVT侵袭功能的影响。方法:1、根据复合酶梯度离心法培养原代EVT,通过免疫细胞化学染色鉴定EVT的来源及纯度。2、实验分为正常对照组(CTR)、smad4干扰组(I-smad4)、smad4过表达组(T-smad4)、HCMV感染组(HCMV)。分别在HCMV接种至EVT细胞48小时、转染si RNA smad4、DNAsmad4 24小时后,利用免疫细胞化学染色技术、逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)、免疫印迹技术(Western Blot)等方法检测各组细胞smad4的表达水平。3、通过体外细胞侵袭实验,来研究EVT感染HCMV后其侵袭功能的变化。结果:1、约95%以上的EVT中发现CK7和c-erb B-2,偶尔可见Vim表达,这一结果说明分离、纯化后培养的EVT为纯度较高,可用于后续实验研究。2、RT-PCR实验结果显示,四组EVT中均有TGF-βRI、TGF-βRII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、MMP2、smad2、smad3、smad4、smad7等基因的信使RNA(即m RNA)表达。具体结果如下:TGF-β1基因在四组实验中的m RNA表达量分别为1.030±0.043、0.684±0.045、1.465±0.047、1.237±0.025;TGF-β2基因在四组中m RNA相对表达量分别为1.015±0.210、0.354±0.116、0.546±0.070、0.527±0.025;TGF-β3基因在四组中m RNA的相对表达量分别为1.002±0.070、0.710±0.009、1.357±0.354、1.189±0.043;TGF-βRI基因在四组中的m RNA相对表达量分别为1.021±0.039、0.856±0.017、0.929±0.065、1.317±0.051,TGF-βRII基因的m RNA在四组中相对表达量分别为1.034±0.073、0.87±0.0035、0.929±0.065、1.296±0.114;smad2基因的m RNA在两组中相对表达量分别为1.000±0.033、0.806±0.0021、0.889±0.0457、1.380±0.064;smad3基因的m RNA在两组中相对表达量分别为1.005±0.13、0.983±0.0301、0.959±0.0477、1.34±0.065;smad4基因的m RNA在四组中相对表达量分别为1.00±0.052、0.150±0.0073、56.48±6.98、1.36±0.080;smad7基因的m RNA在四组中相对表达量分别为1.317±0.051、0.627±0.0026、0.857±0.0322、1.001±0.052;MMP2基因的m RNA在四组中相对表达量分别为1.001±0.028、0.726±0.0188、0.926±0.00887、0.972±0.032。与正常对照组比较,HCMV感染组中TβRI、TβRII、TGF-β1、TGF-β3、smad2、smad3、smad4等基因的m RNA表达水平相对增高,其差异均具有统计学意义(P<0.05),smad7、MMP2等基因的m RNA表达水平则相对下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。上调smad4基因后发现,其下游的细胞因子TGF-β1、TGF-β3的m RNA表达水平升高,TGF-β2、TGF-βRI、TGFβRII、smad2、smad7等各基因m RNA的表达水平明显低于正常组(P<0.05);沉默smad4基因后发现,病毒组各个基因除smad3无明显变化外,其余均表达降低(P<0.05)。3、免疫细胞荧光染色结果提示,在四组EVT中均可见smad4蛋白表达,其在正常对照组、smad4干扰组、smad4过表达组、HCMV感染组中的平均光密度(AOD)分别为0.425±0.044、0.217±0.035、0.734±0.081、0.530±0.086。与正常组比较,HCMV感染组EVT中smad4蛋白表达水平明显升高,smad4过表达组较其他三组,smad4蛋白表达显著升高,P<0.05,差异具有统计学意义,smad4干扰组中smad4蛋白表达较其他三组明显下降,P<0.05,差异均有统计学意义。4、Western Blot实验结果显示,正常对照组、smad4干扰组、smad4过表达组、HCMV感染组中均可见smad4蛋白表达,与正常对照组比较,HCMV感染组中smad4蛋白升高,差异有统计学意义(P<0.05),上调smad4基因后smad4蛋白表达水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);下调smad4基因后,smad4蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。5、体外细胞侵袭实验提示,正常对照组、smad4干扰组、smad4过表达组、HCMV感染组中EVT均可穿过Matrigel基质胶,正常对照组与HCMV转染组中穿膜细胞数分别为(57.3±2.16)、(46.2±2.18)个差异均有统计学意义,(P<0.05),提示HCMV可抑制EVT的侵袭活力。上调、下调smad4基因后,EVT穿膜的细胞数分别为(36.1±2.14)、(65.3±3.21)个,与正常组相比较,两组差异均有统计学意义(P<0.05),实验研究提示smad4基因参与调控EVT的侵袭过程。结论:1、HCMV可能通过TGF-β/smads信号传导通路来抑制原代EVT细胞的增殖及其侵袭功能。2、Smad4基因在HCMV致宫内感染引发异常妊娠结局中起一定作用,其机制可能是HCMV可破坏EVT正常细胞结构,在TGF-β/smad生物信号传导通路中起正向调控作用,从而促进smad4基因表达,增强TGF-β1细胞因子对EVT的抑制作用,以致EVT侵袭功能不足,进而干扰胚胎着床,导致各种异常妊娠结局。